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科研学霸天团，48小时有问必答

问DNA 提取有杂带，有哪些办法可以提取得更干净？

wangyy1990

胶回收即可，一般我们实验室是这么弄的，简单粗暴有效率。

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问G418 筛选小鼠支持细胞确定最佳筛选浓度时，浓度都加到 5mg/ml 了，但两周后为何不见细胞死亡？

马帅儿

方便的话，把你设的浓度梯度和细胞show一下；首先查一下文献，大家都用的什么浓度（如果有的话），一般我们用G418筛选浓度为几百ug/ml，不会像你说的那么高的。。。

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问Chip 实验最后的 PCR 需要注意什么问题？

lh19840703

1. Chip 实验最后免疫沉淀后得到的模板用酚：氯仿或者PCR纯化试剂盒提取都行的，但浓度一般都不会太高，通常在十几到几十ng/uL之间，因为浓度太低，所以纯度（吸光值260:280）也不能准确地测取。最重要的是阳性对照要能在PCR后检查到明显的条带。2. PCR引物设计一般退火温度要相近，分别位于基因组上靶序列上下游各50~150bp左右，最好使靶序列位于PCR产物链的中间位置。正如上面这位同

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问用乙醇沉淀质粒时只能看到一点点沉淀是什么原因？

yeselanshan

没有盐，还有就是加乙醇后一定得混匀。

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问已经跑了 35 个循环，条带仍然很弱，要继续加循环吗？

86964109

一般循环可以加到40个的，可能有突变，不过又不用测序

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问如果电泳中发现DNA几乎不移动，可能是什么原因？

王国的雪

可能是电泳缓冲液的PH值不对。每次应该用新配置的。或者电泳仪的电流太小了。

2 回答3033 围观

问酶切反应中添加酶的量应控制在什么范围，为什么？

yhh931229

为了防止出现星号活性，因为甘油浓度上升，酶量上升都有可能会出现星号活性。

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问限制性内切酶进行酶切DNA实验时DNA必须是纯化的吗？

王国的雪

我觉得是必须的，如果DNA不纯，会影响酶切反应。

2 回答2846 围观

问ChIP 中收细胞一定要用刮刀吗，可以用胰酶消化收集细胞吗？

越努力越幸运AKSR

分析纯就是37.5％

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问关于质粒筛选中的抗生素使用

赤脚草医

可以的，两者都是氨基糖苷类抗生素，都是抑制蛋白合成达到杀细胞作用，我也是用的neomycin抗性质粒，G418筛选，付个质粒的详细文件你看下。。。。。怎么传不了PDF文件？

2 回答2855 围观

问蛋白表达量低，并且多是包涵体形式，请问，如果做EMSA，该怎么办呢？

bylvjing

我们最近也在做这个，做了一个月，各种优化原核表达的条件，还是多数以包涵体的形式存在。处理方法：1、换载体，我们用的标记基因蛋白可能大了，把GST换成了His，不知道结果怎样。2、用Thermo的试剂盒，它能把包涵体中的蛋白复性，但是价格也不便宜3、技术指导说可以用上清直接和探针结合，毕竟还是有上清还是有少量可溶性蛋白的。不知道对你有没有帮助，你可以试试

1 回答3063 围观

问ECOR1做单酶切后去磷酸化，为何连接不出重组的目的质粒？

赵志斌_001

建议单酶切后不要去磷酸化了，载体和基因比例1：10左右，连接好后涂板，然后菌落PCR（一条通用引物+一条特异引物）鉴定10个左右的单克隆，有阳性的就行了。

1 回答4428 围观

问质粒提取中的振荡到底该怎么振荡？

臭屁昱

基本上我都是把管子上下颠倒7-8次，不需要太过用力。如果你用qiagen的试剂盒，直到溶液絮状沉淀全部由蓝变白即可。之后在冰上放置15分钟让其分层就可以离心了。有的时候肉眼看不见沉淀未必就没有沉淀，可以在加酒精洗脱的时候移到小管子里高速离心（14000r）2-5分钟也许就可以看见了。

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问W1B与W2 的顺序可以调换么？或者是否可以重复洗涤？

我是金博士

这两个作用是不同的，W1B是洗脱液，W2是去盐液，顺序是不能换的，但我有些同学会出现调换的情况，这个时候就要重新把基因组回收回来，再继续提取。重复洗涤的意义在哪里呢？基本上按试剂盒上的要求操作就足够了，重复洗涤损失更多。没必要。

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问感受态制备不出来是为什么？

detaibio

做大肠杆菌蛋白表达试验中，感受态的制备主要与以下几个因素有关：1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。DH5α菌株 OD600为 0.5 时细胞密度是 5 × 107/ml ）；2．所有操作均应在无菌条件和冰上进行；3．经 CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加， 24小时达到最高，之后转化

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问自杀质粒构建的重组质粒转化含有自杀质粒的大肠杆菌，是否会有质粒的相容性问题？

大明天桃子

没有必要再转到含有自杀质粒的细菌中了。你构建的含有同源片段的重组质粒本来就具有自杀质粒的功能，转到没有自杀载体的细菌中，其同样能够进行敲除或失活目的基因。另外，如果你有其他特殊目的，实在要转到含有自杀载体的细菌里的话，那你可在你重建的质粒上添加一个不同的抗性基因，这样就可以通过添加抗生素防止质粒丢失了。还有质粒的不相容性是一个缓慢的过程，一般需要几代或几十代或更长的细菌繁殖周期，你做自杀载体的话肯

1 回答2297 围观

问求问大肠组织标本保存条件及方法？

emily_cby

是否需要加rna保护液

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问质粒DNA提取及琼脂糖凝胶电泳检测,琼脂糖凝胶电泳的目的是什么?

我是金博士

针对质粒DNA提取实验，它用来检测DNA是否成功提取。除此之外，还可以用来DNA纯化、验证PCR产物、酶切产物等等。建议先复习下基本知识，这个问题实在太基础了。

1 回答4453 围观

问PCR 电泳验证条带很亮，但酶切后跑电泳后条带很暗很模糊，该怎么改善？

我是金博士

酶切量多少？可以扩大酶切的PCR量试试。

1 回答2412 围观

问质粒怎么都提不出来，该用哪种方法？

琴琴小贝

分支杆菌中的质粒提取：采用经典的碱裂解法。取4.5 mlEP管一支，加0.5 ml菌液，加入1 ml溶液1（15％蔗糖、25 mMTriscl pH8.0、10 mMEDTA pH8.0)，隔时加入溶菌酶，终浓度10 mg/ml，小心混匀。置于0度冰浴30 min，加入2 ml溶菌液2（0.2NNao 1%SDS）,0度冰浴10 min，加1.5 ml 3M NaAC小心混匀。1 000 rpm离

1 回答3359 围观

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