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        Chip 实验最后的 PCR 需要注意什么问题?

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        wang778

        1.请问各位高手,Chip 实验最后 PCR 时,提取的 DNA 模板的浓度和纯度分别是多少才能做出来啊?2. PCR 时的注意事项能否指导一下下,非常感谢!
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        2 个回答

        user-title

        lh19840703

        有帮助
        1. Chip 实验最后免疫沉淀后得到的模板用酚:氯仿或者PCR纯化试剂盒提取都行的,但浓度一般都不会太高,通常在十几到几十ng/uL之间,因为浓度太低,所以纯度(吸光值260:280)也不能准确地测取。最重要的是阳性对照要能在PCR后检查到明显的条带。2. PCR引物设计一般退火温度要相近,分别位于基因组上靶序列上下游各50~150bp左右,最好使靶序列位于PCR产物链的中间位置。正如上面这位同仁所说,PCR产物不能太大(<250bp)。最重要的就是要先用genome DNA和Input验证过,这对引物在PCR体系是能够扩出条带的。另外就是因为Chip得到的产物会比较少,所以一般PCR的循环数要有保证,一般都在30个循环以上(35~45,根据具体结合能力而定)。
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        zyj0630

        有帮助
        1. ChIP中用于PCR的DNA我们使用Qiagen的试剂盒纯化,溶解在TE里,没有测浓度和纯度,不过试剂盒抽提的一般质量都是很好的。2. 关于PCR,要注意的是,扩增片段不能太长,一般应小于200bp,因为基因组经超声处理后会断裂成比较小的片段(200到500bp)。
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