实验问答22,846,062 科研人在看

科研学霸天团，48小时有问必答

问用目标蛋白做IP，WB的时候孵Ub，但是目标条带位置没有ladder，该怎么改善条件？

dxywode

你可以加 NEM 抑制去泛素酶（DUB）的活性，或者干脆用 denaturing IP 去拉目的蛋白，然后检测泛素化。如果真的很难做，可以试试看过表达目的蛋白，再 IP ，当然无论如何也要用 NEM 或者 denaturing IP.

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问树突状细胞培养需要什么条件？

dxywode

在倒置显微镜下观察细胞生长状态：如果没长满，将培养瓶用75%酒精消毒后在超净台内更换新鲜培养液，继续培养。如果细胞已经长满（约80%-90%）则传代后继续培养。

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问免疫组化一抗敷育时间的问题，越长越好吗？有的推荐说至少一小时，通常推荐3小时，避免造成假阴性，如果敷育过夜或者24小时会不会引

dxywode

一抗孵育条件包括孵育时间、温度和抗体浓度，三者之间是相对的关系。浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度而时间决定反应的量。一抗孵育温度有：4℃、室温、37℃，其中4℃效果最佳。至于孵育时间，这与温度、抗体浓度有关，一般37℃1-2h，而4℃则要过夜。其中，4℃最佳，反应最温和，背景较浅。37℃反应速度较快，时间较短。室温个人感觉不如前两者，条件不好控制。最常见的就是4度过夜这种。

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问我想设计一个实验研究的是姜黄素对小鼠作用，主要和一些介素有关，如小鼠介素2、IL-1B、IL-12、肿瘤坏死因子B。哪个最紧密？

peaceful13

你应该先搜索文献，这些因子主要跟哪些细胞相关，采取什么样的形式进行检测，需要有目标样本的确定性，再设计相关实验方法

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问ELSA时酶与抗体交联，你们一般选择什么方法，郭春祥建立的HRP标记抗体的改良过碘酸钠法试过2次，效果一般，配方按照标准配的

bqejjh123

酶与抗体交联的方法有许多种，根据酶的结构不同可采用不同的方法。对于制备HRP结合物，可用戊二醛二步法和过碘酸钠发。尤以简易过碘酸钠法更为常用。

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问二抗敷完了发现敷错了，怎嘛办?

bqejjh123

如果敷错了，可以洗一下再敷，不然二抗会污染

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问大部分抗体收到后4 度短暂保存1-2 周对抗体活性有没有影响？如果抗体很快(1-2 周)会使用，推荐在如何保存？

府宅

试剂盒中的抗体和酶在4度可以放半年

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问流式细胞术最多能用几种抗体去筛选t细胞

府宅

淋巴细胞4.CD3 + T淋巴细胞5.CD4 +与CD8 + T淋巴细胞

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问大家进行细胞给药时，加血清吗？一般正常条件是不是给药都加血清啊？

dxy_gwrp7ndq

还是要看你的细胞种类的，有些细胞生长比较好，并且药物作用时间短可以不加血清的。一般我都是加含5%的血清的。肯定不能等细胞长满板子才加

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问免疫共沉淀的相关问题

dxywode

在细胞裂完离心之后、加入抗体ip之前吸出来的细胞裂解液。可以在wb曝光时显示目的条带的位置以及比较不同泳道之间用于IP反应的细胞蛋白量。

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问做WB转膜时发现marker没转上，但是全程做完扫膜以后内参是有的，目的淡到约等于无是怎么回事儿？

dxywode

marker应该在转完膜孵育抗体之前就可以看到是否成功转至膜上了。在显影时，如果用的是带有CCD相机的仪器读取结果，目的条带读取化学发光信号，而marker要用明场单独拍摄；如果是采用压片，显影定影，则需要提前标记。

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问做WB的时候加入抗体后条带出不来，要怎么快速判断出来是用的抗体有问题还是样本有问题？

dxy_gwrp7ndq

降低抗体浓度,增加二抗对照(不加一抗)。抗体未经纯化使用亲和纯化的抗体,减少非特异性条带。

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问免疫荧光双标操作方法以及注意事项有哪些？

府宅

两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。

3 回答717 围观

问请问老师，pcr序列分组的秘籍与小技巧都有哪些？可否分享一下经验？

dxy_gwrp7ndq

退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩増效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低 PCR 扩増效率。

3 回答549 围观

问在新冠疫苗中，免疫细胞到了什么作用，为什么两到三针疫苗还没有建立有效的免疫机制？

府宅

通常第1、2针疫苗产生初始和免疫记忆，使接种者产生抗体。第3针称「加强免疫」，使产生的抗体效价更高，从而使得疫苗的预防效果更为持久。

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问有什么药物可以诱导小鼠结肠癌从而得到结肠癌小鼠模型？

小布丁瑶瑶

诱变剂氧化偶氮甲烷(AOM)和致炎剂葡聚糖硫酸钠(DSS)可以得到

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问结肠癌小鼠模型如何制备？

lzy必有我师

1)小鼠皮下移植瘤模型的建立(2. 1)将肿瘤组织放置在含庆大霉素的生理盐水中浸泡2min，取出组织，反复用生理盐水冲洗三分钟，冲洗后标本组织无血液，将肿瘤组织用无菌眼科剪分割成直径1. 5mm 大小，放在无菌培养皿中；(2. 2)用20号套管针把剪好的肿瘤组织分别移植到裸小鼠及BNX小鼠右侧背部近腋部皮下，压迫伤口，无出血。每次套管针在电热真空灭菌器中灭菌； (2. 3)将小鼠放入小鼠IVC

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问实验动物饲养密度

soso2007

我一般按照标准一个笼子里养3只，笼子大约是4undefined5undefined40，具体我也没有量过。而一个房间可以养多少只，这个就不知道啦。

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问细菌培养问题

雕刻者

液体培养基和摇床应该都没有问题，因为我准备感受态（同样菌株）时就是用同样的液体培养基（就是不加AMP）和摇床的，感受态细菌长得很好，还有我做了阴性对照，没长细菌。这些问题我以前也考虑过。LB-AMP固体转到LB-AMP液体中的细菌主要问题是细菌生长不良，我现在用固体平板上转种2－3代（挑取生长较快的较大的菌落）后最后挑取较多的细菌转种到液体培养基中，液体培养基中的生长的细菌量增加了。但是液体培养基

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问请教细菌培养是否污染？

鱼小

我的判断是：1、没有染菌。2、同一条链上大小不一很正常，我很多实验都是这样。这个和菌种、生长时间等都有关的。3、那些非常小的应该是刚分裂出来的。4、枯草杆菌一般都不是成链状的，不过我有几次摇瓶出来染色后也成链状。5、真的感觉没有染菌，可以做做16s rna鉴定！

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