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甲醛洋菜胶体电泳 （formaldehyde-agarose gel electrophoresis）甲醛是一种常用的RNA 变性剂。在进行甲醛洋菜胶体电泳分析时，必须先配制含有甲醛的洋菜胶体，RNA 也必须先以甲醛及formamide 进行变性处理，以确保其二度结构充分被打开。由于甲醛可能是一种致癌物质，配制胶体及进行电泳分析时都应在抽气橱里小心操作；进行电泳时所使用的缓冲液为MOPS （3-[N-morpholino] propanesulfonic acid）。此外，含有甲醛的洋菜胶体比较滑溜，容易破裂，在移动胶体时应特别留神。由于rRNA 占细胞RNA总量的80~85%,以ethidium bromide 染色后，呈现于胶体上的两个主要RNA色带应该分别是large 与small rRNAs （真核生物为28S 与18S,原核生物为23S 与16S）；散布于small rRNA 附近，呈淡淡smear 的就是mRNAs,这是因为mRNAs 存在量不多，而且长度不一的缘故。长度较短的5S rRNA 及tRNA 等则在胶体下方也以特定色带呈现。

1） 取出8 支1.5 mL微量离心管，分别标示为U-1, U-2, I-1, I-2, #1, #2, #3 及#4,并根据下表所示依序加入各项试剂 （体积单位为 μL）。U-1, U-2, I-1 及I-2 分别为大肠杆菌所分得的RNA,#1, #2, #3及 #4 分别是胞外转录反应所得到的RNA……

要进行北方杂合反应前，必须先将RNA自洋菜胶体转移至硝化纤维纸（nitrocellulose membrane） 或尼龙膜 （nylon membrane） 上，这一个过程称为转印 （blotting）。 一般常用的方法包括毛细管转移法 （capillary transfer）、真空转移法 （vacuum transfer） 与电转印法 （electroblotting）。 毛细管转移法借助吸水纸吸收转移缓冲液时所产生的牵引力量将RNA自洋菜胶体转移至膜上；要转印完全，起码需要作用6 h以上。 虽然所需花费的时间比较长，以其不须要特别的仪器设备，毛细管转移法目前仍被普遍采用。 若分析RNA时采用变性聚丙烯酰胺胶体电泳，则必须以电转印法进行RNA转印。至于膜的选择，硝基纤维素膜的优点是比较不会产生非专一性反应；不过其一旦被润湿再烘干的后，容易碎裂，不适用于进行多次杂合反应。 尼龙膜的优点是韧性好，与核酸结合的能力也相当强，正可以弥补硝基纤维素膜的缺点，现已成为主流。 一旦将RNA转移至膜上后，即可以利用紫外线照射法 （uv irradiation） 或真空干燥法 （在真空下80℃加热2

北方杂合反应的步骤主要包括： （1） 加入核酸探针，使与固定于尼龙膜上的特定RNA 进行杂合反应； （2） 待杂合反应结束后以含盐缓冲液与SDS 洗掉非专一性结合于尼龙膜上的核酸探针。 进行反应时应注意下列几个问题： a.实验操作过程仍应尽可能避免RNase 的污染； b.反应前应先进行杂合前置反应（prehybridization），以便减少核酸探针与尼龙膜的间的非专一性 ...

蛋白质在细菌中表现后，以反复的冷冻-解冻方法打破细胞，再用硫酸铵把蛋白质沉淀下来，此步骤可以去除大部份核酸、多醣、脂质等杂物。

进行杂合反应时所使用的探针若为放射性物质所标定者，杂合讯息可经由放射显影术 （autoradiography） 侦测出来；若为DIG所标定者，则需借助anti-DIG抗体与碱性去磷酸酶 （alkaline phosphatase, AP） 的conjugate,并利用碱性去磷酸酶的酵素活性转现杂合反应讯息。 目前常用来进行碱性去磷酸酶呈色反应的基质为NBT （nitroblue tetrazolium） 与BCIP （5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate,toluidinium salt）； 此外，也可以选用CSPD或CDP-Star等试剂，以增加检测敏感度。

不同大小的蛋白质分子进入胶体过滤管柱，可依其分子量差异分离；是一种广泛应用的partition色析法 （Pharmacia操作手册， Gel Filtration）。

各种蛋白质分子上可能带有不同的电性，经过离子交换管柱，可依其分子带电性的差异而分离开来 （Pharmacia 操作手册，Ion Exchange）。

若表达蛋白质上含有一段六个His 的片段，而亲和吸附胶上接有镍离子，此蛋白质会特异性地结合到吸着胶体；洗去杂质后可imidazole 洗脱目标蛋白质。

Bradford 的dye-binding method 是利用Coomassie brilliant blue G-250 （CBG） 可与蛋白质结合而变色的特性来定量。（Bradford, 1976）；若试样中的蛋白质量较多，则结合到蛋白质而变色的CBG 也多，因而呈色较深。下例是以一组标准蛋白质为对象，制作一条蛋白质量与吸光度的标准校正线。

酶活性分析法检定蛋白质：表现出来的酶GUS可以水解其基质衍生物pNPG,所产生的黄色生成物p-nitrophenol,可供活性测定 （Jefferson et al, 1986）；

SDS 平板胶片铸造︰1） 整理出两组玻璃片及白板铸胶组合，先用酒精拭净，并选择合适的间隔条（0.75 mm） 组合起来。请熟悉铸胶三明治组合的正确组装方式，以免灌入的胶液漏出来。2） 三明治组合后直立站好，准备所要浓度的SDS 胶体溶液如表4.2. 两片0.75mm 厚的平板胶片约需10 mL 分离胶体溶液，以及5 mL 焦集胶体溶液。APS液到最后才加入，未加APS 以前可在真空中抽去溶液中的气体……

蛋白质经SDS-PAGE后，胶片浸入转印缓冲液，蛋白质可被转印到硝化纤维纸（nitrocellulose） 上，先经尿素洗去SDS,并使蛋白质回复原态抗原性，可使用抗体进行免疫染色 （Towbin et al, 1979）。

转印到纸上的蛋白质抗原，可与其专一性抗体结合，再以二次抗体-酶结合体（2nd Ab-HRP） 或Protein A-HRP 呈色；可在一群转印色带中，专一性地挑出目标蛋白质，是最有用的检定工具 （Burnett,1981）。

最大或然数（most probable number,MPN）计数又称稀释培养计数，适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有特殊生理功能的类群。其特点是利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度。本法特别适合于测定土壤微生物中的特定生理群（如氨化、硝化、纤维素分解、固氮、硫化和反硫化细菌等。见附表23-1）的数量和检测污水、牛奶及其他食品中特殊微生物类群（如大肠菌群）的数量，缺点是只适于进行特殊生理类群的测定，结果也较粗放，只有在因某种原因不能使用平板计数时才采用。

稀释平板计数是根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。计数时，首先将待测样品制成均匀的系列稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使成单个细胞存在（否则一个菌落就不只是代表一个细胞），再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。此法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数，故又称活菌计数。一般用于某些成品检定（如杀虫菌剂等）、生物制品检验、土壤含菌量测定及食品、水源的污染程度的检验。

显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。

微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体很小，只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。

霉菌的营养体是分枝的丝状体。其个体比细菌和放线菌大得多，分为基内菌丝和气生菌丝。气生菌丝中又可分化出繁殖丝。不同霉菌的繁殖菌丝可以形成不同的孢子。霉菌菌丝较粗大，细胞易收缩变形，且孢子容易飞散，所以制标本时常用乳酸石炭酸棉蓝染色液。此染色液制成的霉菌标本片的特点是：细胞不变形，具有杀菌防腐作用，且不易干燥，能保持较长时间，溶液本身呈蓝色，有一定染色效果。利用培养在玻璃纸上的霉菌作为观察材料，可以得到清晰、完整、保持自然状态的霉菌形态；也可以直接挑取生长在平板中的霉菌菌体制水浸片观察。

放线菌自然生长的个体形态的观察现多用玻璃纸琼脂透析培养法。玻璃纸具有半透膜特性，其透光性与载玻片基本相同，采用玻璃纸琼脂平板透析培养，能使放线菌生长在玻璃纸上，然后将长菌的玻璃纸剪取小片，贴放在载玻片上，用显微镜镜检可见到放线菌自然生长的个体形态。