• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        甲醛洋菜胶体电泳

        互联网

        3921

        甲醛洋菜胶体电泳 (formaldehyde-agarose gel electrophoresis)甲醛是一种常用的RNA 变性剂。在进行甲醛洋菜胶体电泳分析时,必须先配制含有甲醛的洋菜胶体,RNA 也必须先以甲醛及formamide 进行变性处理,以确保其二度结构充分被打开。

        由于甲醛可能是一种致癌物质,配制胶体及进行电泳分析时都应在抽气橱里小心操作;进行电泳时所使用的缓冲液为MOPS (3-[N-morpholino] propanesulfonic acid)。此外,含有甲醛的洋菜胶体比较滑溜,容易破裂,在移动胶体时应特别留神。

        由于rRNA 占细胞RNA总量的80~85%,以ethidium bromide 染色后,呈现于胶体上的两个主要RNA色带应该分别是large 与small rRNAs (真核生物为28S 与18S,原核生物为23S 与16S);散布于small rRNA 附近,呈淡淡smear 的就是mRNAs,这是因为mRNAs 存在量不多,而且长度不一的缘故。长度较短的5S rRNA 及tRNA 等则在胶体下方也以特定色带呈现。

        仪器用具:

        65℃恒温水槽;微量离心机;Mupid II 迷你电泳槽及铸胶器;UV transilluminator;防护面罩;拍立得相机;抽气橱

        药品试剂:

        自菌体抽取的RNA (I-1, I-2, U-1, and U-2) 与胞外转录反应所制备的正意股及反意股RNA (#1, #2, #3, and #4)。

        5×formaldehyde gel running buffer (0.1 M MOPS, pH 7.0; 40 mM sodium acetate; 5 mM EDTA)

        Formaldehyde gel loading buffer (0.25% bromophenol blue; 0.25% xylene cyanol;50% glycerol; 1 mM EDTA)

        Ethidium bromide (1 μg/μL in dH2O/DEPC)

        dH2O/DEPC

        方法步骤:

        ◆ 注意:

        a. 下列实验主要参照Sambrook and Russell (2001) 的方法。

        b. 进行下列实验时请务必戴手套。

        c. 甲醛与formamide 都放在抽气橱内。


        准备一片1.2%甲醛洋菜胶体:

        1) 秤取0.48 g agarose置100 mL血清瓶,加入25 mL dH2O/DEPC.

        2) 以微波炉加热溶解的后,微微晃动血清瓶使混合均匀,再移至60℃恒温水槽静置5 min.

        3) 将装着agarose 溶液的血清瓶移至抽气橱,加入8 mL 的5× formaldehyde gel running buffer 及7.2 mL 的甲醛,轻轻摇晃血清瓶以便混合均匀。

        胶体总体积为40 mL,为了避免agarose 溶液因温度快速下降,很快便凝固,应力求动作迅速,但应避免剧烈摇晃,以免弄出一大堆气泡,影响胶体凝结。

        4) 尽速于抽气橱内把混合液倒入胶体铸模,并插入样本梳 (teeth comb)。胶体凝固至少需时30 min.

        电泳:

        1) 要进行电泳时,把已凝固的洋菜胶体放进电泳槽,并加入适量1×formadehyde gel running buffer.

        2) 以50 V 定电压预跑5 min.

        3) 依序注入上列8 个RNA 样本,以50 V 定电压进行电泳,待追踪染剂移动至胶体三分的二处时,关闭电源,将胶体移至UV transilluminator box,观察RNA 色带的存在情形,并拍照存证。

        注意:这一片胶体往下将用来进行北方转印实验,请小心处置!

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序