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        Northern Blotting反应

        互联网

        4109

        北方杂合反应的步骤主要包括:

        (1) 加入核酸探针,使与固定于尼龙膜上的特定RNA 进行杂合反应;

        (2) 待杂合反应结束后以含盐缓冲液与SDS 洗掉非专一性结合于尼龙膜上的核酸探针。 进行反应时应注意下列几个问题:

        a. 实验操作过程仍应尽可能避免RNase 的污染;

        b. 反应前应先进行杂合前置反应(prehybridization),以便减少核酸探针与尼龙膜的间的非专一性结合反应;

        c. 如果所使用的核酸探针是以random priming 或PCR 等方法所制备的双股DNA 探针,使用前务必先加热变性;

        d. 选用适当的严苛度 (stringency) 进行杂合反应及后续的转印膜漂洗工作,以便增强杂合反应讯息,并减少噪声,这主要可以从温度与盐浓度两个方面加以考量。

        仪器用具:Crosslinker (Stratalinker 1800, Stratagene);塑料盒;平端镊子;封口机;42℃恒温槽;60℃恒温槽

        药品试剂:6×SSC (0.9 M NaCl, 90 mM sodium citrate)尼龙膜;Hybridization solution [formamide, 50% (v/v); 5×SSC; blocking reagent, 2% (w/v);N-lauroylsarcosine, 0.1% (w/v); SDS, 0.02% (w/v)]3MM 滤纸;2×SSC, 0.1% SDS;0.1×SSC, 0.1% SDS

        方法步骤:

        1) RNA 转印步骤结束后,移除电泳胶上的吸水纸与3M 滤纸。

        2) 把尼龙膜连同电泳胶一齐移置于干净卫生纸上,并请小心维持电泳胶与尼龙膜的相对位置。

        3) 以防水笔在尼龙膜上标出电泳胶样本孔的位置,并以剪刀剪掉尼龙膜左上角,以便标记电泳胶的左右方位。

        4) 小心地拉开尼龙膜,将的放置于6×SSC (20 mL) 浸泡5 min.

        5) 以平端镊子夹起尼龙膜,待6×SSC 滴干的后,把尼龙膜平放于卫生纸上,风干至少30 min.与电泳胶接触的那一面应朝上。

        6) 以Stratalinker 1800 进行uv 连结反应。

        7) 杂合前置反应:

        a) 将10 mL 杂合溶液注入一个塑料袋。

        b) 把已经风干的尼龙膜移置于塑料袋内,小心地把气泡移除的后,以封口机密封好,再移至42℃恒温槽进行杂合前置反应1~2 h.


        8) 核酸探针变性反应:

        a) 以微量移液器小心地把PCR 产物移至新的微量离心管。

        b) 将装着核酸探针的微量离心管放入沸水中加热10 min.请记得以夹子固定微量离心管的盖子,以免加热时盖子爆开。

        c) 把离心管移入冰浴里静置3 min.

        d) 瞬间离心后,取出已被变性的核酸探针,加到5 mL 的杂合溶液。

        9) 杂合反应:

        a) 剪开塑料袋一角,倒出塑料袋内杂合前置反应所使用的溶液,并加入新配的含有核酸探针的杂合溶液 (8-d)。

        b) 小心移除气泡,并以封口机密封塑料袋。

        c) 如前节所述将塑料袋移至42℃恒温槽,杂合反应将进行过夜。

        10) 以含盐缓冲液与SDS漂洗转印膜 (Northern blot):

        a) 拿出塑料袋,塑料方盒以清水冲洗干净的后,装入80 mL [2×SSC, 0.1%SDS]. 剪开塑料袋,把尼龙膜取出放进 [2×SSC, 0.1% SDS],于室温漂洗2 次,每次5 min.

        b) 续以100 mL [0.1×SSC, 0.1% SDS] 于60℃洗2 次,每次15 min.溶液需先置于60℃恒温水槽中预热。

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