以酶联免疫反应与碱性去磷酸酶呈色反应侦测杂合讯息

进行杂合反应时所使用的探针若为放射性物质所标定者，杂合讯息可经由放射显影术 （autoradiography） 侦测出来；若为DIG所标定者，则需借助anti-DIG抗体与碱性去磷酸酶 （alkaline phosphatase, AP） 的conjugate,并利用碱性去磷酸酶的酵素活性转现杂合反应讯息。 目前常用来进行碱性去磷酸酶呈色反应的基质为NBT （nitroblue tetrazolium） 与BCIP （5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate,toluidinium salt）； 此外，也可以选用CSPD或CDP-Star等试剂，以增加检测敏感度。

仪器用具：平端镊子；旋转摇荡器 （rotary shaker）；

药品试剂：DIG nucleic acid detection kit （Roche），内含：Anti-DIG-AP conjugate

NBT/BCIP stock solution;Blocking reagent；Washing buffer （Maleic acid buffer + 3% Tween 20, v/v）；Maleic acid buffer （0.1 M maleic acid; 0.15 M NaCl; adjust to pH 7.5 with NaOH）；Blocking solution （1% blocking reagent in maleic acid buffer）；Detection buffer （0.1 M Tris-HCl, pH 9.5; 0.1 M NaCl; 50 mM MgCl₂）；TE （10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA）；Color-substrate solution （需要使用时取10 mL 的detection buffer,加入200 μL;NBT/BCIP stock solution 均匀混合）

方法步骤：

◆ 注意：

a. 以下反应条件与程序主要是参照DIG nucleic acid detection kit 制造厂商所提供的产品说明书。

b. 北方与南方杂合的尼龙膜可同步处理，所有反应于室温进行。

c. 以平端镊子将尼龙膜自一种溶液移至次一种溶液时，尽可能滴干前者的残留部份，以免影响后续反应。

d. 浸洗过程应以摇荡器低速摇动 （50 rpm），以便加强作用。

1） 进行anti-DIG/AP conjugate 与DIG-核酸探针的免疫结合反应：

a） 以50 mL 的washing buffer 浸洗尼龙膜1 min.

b） Blocking:把尼龙膜放入20 mL blocking solution 作用30 min,以便填充尼龙膜上的非专一性结合部位。

c） 取出2 μL 的anti-DIG-AP conjugate,并以10 mL 的blocking solution 稀释。

d） 免疫结合反应：把anti-DIG-AP conjugate 稀释液连同尼龙膜一起放入塑料袋内，仔细除去气泡并封口的后，低速摇动作用30 min.

e） 以50 mL washing buffer 浸洗尼龙膜2 次 （每次15 min），以便去除多余及非专一性结合于尼龙膜的anti-DIG-AP conjugate.

f） 将尼龙膜放置于20 mL 的detection buffer 漂洗2 min.

2） 碱性去磷酸酶呈色反应：

a） 取出尼龙膜，放入10 mL 现配的color-substrate solution,并随即把尼龙膜及作用溶液移至黑暗环境 （例如抽屉内） 作用。每几分钟检视一次，待紫色条带出现时即可终止反应。

b） 欲终止反应时，请把尼龙膜移至50 mL TE 浸渍5 min.

c） 拿出尼龙膜，滴干反应液后放置于卫生纸上风干至少30 min,加以护贝即可保存。