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1. 将酵母细胞培养在3ml选择性培养基中，30℃过夜旋转培养。2. 稀释过夜培养的菌液，重新在10ml培养基中培养细胞。3. OD600达到1.0时，收菌，4000rpm/min离心5min弃培养基。4. 将细胞悬浮于400μlAE缓冲液（50mMSodiumAcetate10mMEDTA调整pH值至5.2）。5. ...

Tissue collection storage microdissection sectioning: See separate protocol. Tissue handling: Note that all fresh tissue should be handled as BioSafety Level 2 materials (wear gloves lab coat etc.). D ...

一、直接检出病毒核酸 　　1．核酸杂交（Nucleic acid hybridization） -临床病毒学中报速诊断方法通常是检测标本中的病毒抗原，然而核酸分子杂交具有高度敏感性和特异性，斑点杂交 (Dot hybridization) 广泛用于检测呼吸道标本，尿标本中的病毒核酸。标本滴加到硝酸纤维素膜上，病毒DNA结合到膜上，在原位进行硷变性处理后，有放射标记的已知病毒DNA片段杂 ...

与rRNA和tRNA不同的是，哺乳动物细胞的绝大部分mRNA在其3'端均有一poly(A)尾，因此可以用oligo(dT)－纤维素亲和层析法从大量的细胞RNA中分离mRNAdmonds等，1971;At Leder，1972）。在构建cDNA文库时， 必须经上述纯化步骤制备mRNA模板。进行Northern杂交或Sl 核酸酶作用图分析时，与总RNA相比，采用poly(A)+ RNA能获得更为满意的 ...

ＤＮＡ的双螺旋结构中碱基对在整个大分子链形成一个大的pai键这个结构在导电高分子中很常见，这个键就是导电高分子导电的核心关键，而ＤＮＡ中的这个大pai键的作用可以使电子在高分子链上进行移动．其结果对ＤＮＡ控制蛋白质的的合成有什么影响，或者说是对病变的ＤＮＡ（癌细胞的ＤＮＡ）有什么抑制作用．目前科学家们还在研究中，仅关于其电子运输的机理就已经众说纷纭，我看到的就两个：多步骤跃迁和快速短距离的电子传递 ...

7.1实验原理 核酸分子杂交是通过配对碱基对之间的非共价键（主要是氢键）结合，从而形成稳定的双链区。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。分子杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与DNA的二条单链之间进行。由于DNA一般都以双链形式存在，因此在进行分子杂交时，应先将双链DNA分子解 ...

一、直接检出病毒核酸 　　1．核酸杂交（Nucleic acid hybridization） -临床病毒学中报速诊断方法通常是检测标本中的病毒抗原，然而核酸分子杂交具有高度敏感性和特异性，斑点杂交 (Dot hybridization) 广泛用于检测呼吸道标本，尿标本中的病毒核酸。标本滴加到硝酸纤维素膜上，病毒DNA结合到膜上，在原位进行硷变性处理后，有放射标记的已知病毒DNA片段杂并，两条单股 ...

一、目的： 学习和掌握应用紫外分光光度法直接测定核酸含量的原理及技术。熟悉紫外分光光度计的基本原理与使用。 二、原理： DNA和RNA都有吸收紫外光的性质，它们的吸收高峰在260nm波长处。吸收紫外光的性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质，不论是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性，核酸和核苷酸的摩尔消光系数（或称吸收系数）用E（P）来表示，E（P） ...

一、目的： 了解并掌握地衣酚法测定RNA含量的基本原理和具体方法。 二、原理： RNA含量测定，除可用紫外吸收法及定磷法外，常用地衣酚法测定。其反应原理是：当RNA与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变成糠醛，后者与3，5-二羟基甲苯（地衣酚orcinol）反应，在Fe 3+或Cu 2+催化下，生成鲜绿色复合物。反应产物在670nm处有最大吸收。RNA浓度在20―250μg・ml-1范围内 ...

实验前的准备工作：一、实验器具与材料： 1、移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl 2、吸头：1ml、200μl、20μl 3、匀浆管：5ml 4、吸头台：放置1ml吸头的一个，放置20μl吸头的一个 5、EP管：1.5ml、0.2ml、100μl 6、试剂瓶：2个60ml的棕色试剂瓶（广口，带盖） 1个125ml的白色试剂瓶（放无水乙醇） 7、量筒：50ml、250ml、500m ...

原位核酸分子杂交技术简称原位杂交(in situ hybridization ISH)是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统，通过组织化学或免疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成带颜色的杂交信号，在显微镜或电子显微镜下进行细胞内定位。这一技术为研究单一细胞中DNA和编码各种蛋白质、多肽的相应mR ...

一、Feulgen氏染色法： 该方法是显示DNA的一种常用方法。其基本原理是在酸水解下，去DNA中的嘌呤，使脱氧核酸的醛基暴露出来，然后再与Schiff氏试剂反应，生成紫红色产物，用于显微分光光度计和流式细胞测量计对细胞进行静态DNA测量和流式细胞测量。 操作方式： （1）切片常规脱蜡至水。 （2）蒸馏水洗，1NHCI水溶稍洗。 （3）浸入1NHCI水溶液60℃，8-10分钟。 （4）取出后， ...

mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。此法利用mRNA 3’末端含有Poly（A+）的特点，在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚（dT）纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA。寡聚(dT)纤维素柱纯化mRNA：试剂试剂：1、 3 ...

mRNA的分离 与rRNA和tRNA不同的是，哺乳动物细胞的绝大部分mRNA在其3'端均有一poly(A)尾，因此可以用oligo(dT)－纤维素亲和层析法从大量的细胞RNA中分离mRNAdmonds等，1971;At Leder，1972）。在构建cDNA文库时， 必须经上述纯化步骤制备mRNA模板。 进行Northern杂交或Sl 核酸酶作用图分析时，与总RNA相比，采用poly(A)+ RN ...

分子生物学技术的突飞猛进发展，也推动了病理学的进展。原位杂交技术时分子生物学领域中最常用的基本技术方法之一，是核酸分子杂交技术中的一种。 核酸原位杂交技术最早应用于60年代末期，但当时仅限于对体外条件下啊核酸分子片段的初步工作，直到1975年才见到较为系统地介绍在细胞内进行原位杂交的技术。而在常规福尔马林固定，石蜡包埋的组织切片中进行简便易行的原位杂交则是在80年代中后期。近年来，随着方法更为完善 ...

限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶)它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独 ...

RNA的提取准备试剂：氯仿，异丙醇，75�乙醇，无RNase的水或0.5�SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制)操作步骤：1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎每50-100mg组织加入1ml TRIzol用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10�。b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸 ...

cDNA文库构建的过程分为六个阶段： 阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链 阶段2：cDNA第二链的合成 阶段3：cDNA的甲基化 阶段4：接头或衔接子的连接 阶段5：Sepharose CL-4B凝胶过滤法分离cDNA 阶段6：cDNA与λ噬菌体臂的连接阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链1.在置于冰上的无菌微量离心管内混合下列试剂进行cDNA第一链的合成： poly(A) RNA (1μg ...

基本概念1）基因工程（genetic engineering）、基因克隆、DNA重组、DNA克隆、分子克隆。2）克隆（clone）：无性繁殖——应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成具有自我复制能力的DNA分子（重组子），再通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因转化子，进行扩增、提取获得大量同一DNA，或其表达产物。基因克隆的基本步骤1）连接外源基因和克隆载体，构建重组DNA分子； ...

（1）揭示基因结构；（2）染色体上的基因及其基因位点；（3）分离与鉴定基因。 DNA测序方法：化学法：Maxam-Gilbert化学修饰法。1） 基本原理：用化学试剂处理具有末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割并产生一组具有不同长度的DNA链降解产物，经凝胶电泳分离和放射自显影后，可直接读出待测DNA片段的核苷酸序列。2） 基本步骤：（1）同位素标记DNA片段的5’ ...