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        核酸的定量测定:衣酚(苔黑酚)法

        互联网

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        一、目的:

        了解并掌握地衣酚法测定RNA含量的基本原理和具体方法。

        二、原理:

        RNA含量测定,除可用紫外吸收法及定磷法外,常用地衣酚法测定。其反应原理是:当RNA与浓盐酸共热时,即发生降解,形成的核糖继而转变成糠醛,后者与3,5-二羟基甲苯(地衣酚orcinol)反应,在Fe3+或Cu2+催化下,生成鲜绿色复合物。反应产物在670nm处有最大吸收。RNA浓度在20―250μg・ml-1范围内,光吸收与RNA浓度成正比。地衣酚法特异性差,凡戊糖均有此反应,DNA和其他杂质也能与地衣酚反应产生类似颜色。因此,测定PNA时可先测得DNA含量再计算RNA含量。

        三、器材与试剂:

        1.器材:
        ①分析天平。

        ②沸水浴锅。

        ③试管。

        ④吸量管。

        ⑤分光光度计。

        2.试剂
        ①RNA标准溶液(须经定磷确定其纯度):取酵母RNA配成100微克/毫升的溶液。

        ②样品待测液:配成每毫升溶液含RNA干燥制品50―100微克。

        ③地衣酚试剂:先配0.1%三氯化铁的浓盐酸(分析纯)溶液,实验前用此溶液作为溶剂配成0.1%地衣酚溶液。

        四、操作步骤:

        1.标准曲线的制作
        取12支干净烘干试管,按下表编号及加入试剂。平等作两份。加毕置沸水浴加热25min,取出冷却,以零号管作对照,于670nm波长处测定光吸收值。取两管平均值,以RNA浓度为横坐标,光吸收为纵坐标作图,绘制标准曲线。

        2.样品的测定
        取两支试管,各加入2.0ml样品液,再加2.0ml地衣酚-Cu2+试剂。如前述进行测定。

        五、结果与讨论:

        1.绘制出标准曲线

        2.RNA含量的计算
        根据测得的光吸收值,从标准曲线上查出相当该光吸收的RNA含量,按下式计算出制品中RNA的百分含量:

        注意事项

        (1)样品中蛋白质含量较高时,应先用5%三氯乙酸溶液沉淀蛋白质后再测定。

        (2)本法特异性较差,凡属戊糖均有反应。微量DNA无影响,较多DNA存在时,亦有干扰作用。如在试剂中加入适量CuCl2・2H2O可减少DNA的干扰,甚至某些已糖在持续加热后生成的羟甲基糖醛也能与地衣酚反应,产生显色复合物。此外,利用RNA和DNA显色复合物的最大光吸收不同,且在不同时间显示最大色度加以区分。反应2min后,DNA在600nm呈现最大光吸收,而RNA则在反应15min后,在670nm下呈现最大光吸收。

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