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Annexin-V-FLUOS和PI双标记法检测细胞凋亡 凋亡早期，细胞表面可发生改变，细胞膜的改变之一是磷脂酰丝氨酸（PS）从胞膜内转移到胞膜外层，从而使PS暴露在细胞表面。在凋亡发生时，巨噬细胞能特异性识别暴露在细胞表面的PS，从而吞噬凋亡细胞和凋亡小体，使机体免于细胞内容物释出所引起的炎症反应和伴有的组织细胞坏死。Annexin-V 是一种Ca2+依赖性的磷脂结合蛋白，与PS有高度亲 ...

基于凋亡诱导蛋白酶变化的细胞凋亡检测 半胱-天冬氨酸蛋白酶家族（cysteinyl aspartate specific protease，Caspase）是近几年人们发现的与ced-3同源的一类蛋白酶，具有10余种成员。“C”代表半胱氨酸在酶的活性中心，“aspase”代表其底物切割蛋白作用位点都在天冬氨酸羧基端，这是caspase家族最为独特的催化活性。Caspase一般以非活化的酶 ...

DNA ladder法检测细胞凋亡 发生细胞凋亡时，内源性核酸酶被激活，染色体DNA链在核小体之间被切割，形成180～200个碱基或其整数倍的DNA片段，将这些DNA片段抽提出来进行电泳，可得到DNA梯状条带（DNA ladder）。【材料与试剂】凋亡细胞；蛋白酶K（500μg/ml）8mol/L 醋酸钾白细胞裂解液：pH8.0，10mmol/L Tris-HCl，10mmol/L NaC ...

凋亡指数和细胞活力的定量测定（荧光染色法） 将细胞悬液与DNA结合的荧光染料混合，应用荧光显微镜观察以显示和计数伴有异常染色质的组织细胞。常用染料为丫啶橙，染色后可以检测整个细胞群中有多少细胞发生了凋亡，但不能区别活细胞和死细胞。因此将丫啶橙和溴化乙啶混合使用，根据两种染料的吸收情况可鉴定死、活细胞。【材料与试剂】100μg/ml丫啶橙或100μg/ml丫啶橙与100μg/ml溴化乙啶的混 ...

末端转移酶标记技术（TUNEL法）检测细胞凋亡【材料与试剂】（1）TUNEL试剂盒（Boehringer Mannheim公司产品）： ①从瓶2中取出标记液100μl分别作为两个阴性对照. ②将瓶1的全部溶液50μl加入瓶2剩余的450μl标记液中，使其成为500μl的TUNEL混合物。（2）POD转换液（一旦溶解，储存于4℃，不得再冻存）（3）漂洗液：PBS（4）固 ...

电子显微镜检测法检测细胞凋亡 具有凋亡特征的细胞程序性死亡后，可在扫描或透射电镜下观察到“凋亡小体”，该小体系由细胞膜卷曲、脱落形成的小泡，其内包含有完整的细胞器及核片段。这种小体易被巨噬细胞、上皮细胞等吞噬，借以清除正常发育过程中死亡的细胞。细胞坏死则无此小体形成。但是并非所有发生程序性死亡的细胞皆形成凋亡小体。【仪器与试剂】射电子显微镜或扫描电子显微镜，组织切片机，离心机，离心涂片机 ...

蛋白酶PARP的测定检测细胞凋亡 聚（腺苷二磷酸-核糖）多聚酶（PARP）为一种依赖Zn2+的真核DNA结合蛋白，可特异性地识别DNA断裂末端并结合， 是一种重要的DNA修复酶。在细胞凋亡发生的早期， PARP是caspase家族（如caspase3 和7）的作用底物，后者可使PARP的DNA 修复功能丧失。Caspase可将 113kD的PARP水解为89kD和24kD的两个片断。 本方 ...

Caspase 3 活性测定（FIENA法）检测细胞凋亡 Caspase3 的激活在凋亡过程的细胞事件启动中起着重要作用，有证据表明，在蛋白酶级联切割过程中，Caspase 3处于核心位置。本法运用荧光酶联免疫吸附法（flurometric immunosorbent enzyme assay， FIENA）的原理， Caspase3激活后会作用于其特异的底物: 乙酰化天冬氨酸-谷氨酸- ...

原位末端转移酶标记技术 （ISEL）检测细胞凋亡 根据细胞凋亡时核酸内切酶被激活，将细胞核染色体DNA从核小体连接处切断，产生单股或双股DNA链。根据这一生化特性，将外源性核苷酸和酶（末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）和DNA聚合酶I或Klenow大片段）渗入到凋亡细胞中，催化标记的外源性核苷酸与断裂的 DNA链相结合，并通过一定的显示系统显色。 由于凋亡细胞内的内源性核酸酶被激活后， ...

荧光标记法检测细胞凋亡【仪器与试剂】（1） TdT酶（25U/μl）；（2） 生物素标记的-dUTP（Biotin-dUTP）或地高辛标记的dUTP （Digoxingening-11-dUTP）1nmol/μl；（3） 反应缓冲液；（4） 洗涤缓冲液；（5） 异硫氰酸荧光素（FITC）标记的亲合素或链霉亲合素 （2 ...

免疫学方法（ELISA法）检测细胞凋亡 细胞凋亡事件发生时，会出现蛋白质和核酸分子结构的改变，形成新的表位。利用免疫学方法对这些表位进行鉴定，有助于判断样本中细胞凋亡事件的发生。细胞凋亡的发生，是由于内源性核酸内切酶的激活，这种钙和镁依赖性核酸酶容易进入的核小体间区解开双链DNA，产生单/低聚核小体片段，而核小体本身由于DNA与组蛋白H1、H2A、H2B、H3和H4形成紧密复合物而不被核酸 ...

流式细胞分析术检测细胞凋亡的基本原理 流式细胞分析术在现代细胞分子生物学研究中起着越来越重要的作用。由于流式细胞分析是通过对单个细胞性状的快速测定，并结合先进的计算机分析系统，使得在短时间内可对大量细胞进行定性、定量测定。新一代流式细胞分析仪尚具有同时对单个细胞进行多参数测定的功能，可同时对细胞膜、细胞内蛋白质及核DNA进行标记后检测。 流式细胞分析术在细胞凋亡研究中具有特殊意义。 ...

酶标记法检测细胞凋亡【材料与试剂】（1） 平衡缓冲液；（2） 反应缓冲液；（3） TdT酶；（4） 反应终止/洗涤液；（5） 过氧化物酶标记的抗地高辛抗体；（6） 蛋白酶K消化液：20μg/ml蛋白酶K溶于PBS；（7） 30％H2O2；（8） DAB显色液：0.05％的diaminobenzidine （DAB）溶于PBS，用前过滤 ...

靶细胞DNA片段的定量分析与杀伤细胞介导的细胞溶解试验 应用此法可以研究CTL、NK细胞介导的凋亡。通过125I-UdR和51Cr双标记细胞，可以同时检测DNA片段和溶解的细胞。【材料及材料】 (1) 125I-UdR标记细胞核和51Cr标记细胞浆的靶细胞：用完全RPMI-1640培养液配成5×104～1×105/ml的细胞悬液；(2) 未标记的CTL；CTL杀伤试 ...

Annexin法检测细胞凋亡基本与Annexin-V-FLUOS和PI双标记法相同，早期凋亡细胞因细胞膜的磷脂对称性改变而使磷脂酰丝氨酸（PS）暴露于细胞膜外，PS可特异结合标记有异硫氰酸荧光素（FITC）的连接素V（Annexin V），但细胞仍然保持其细胞膜的完整性，使荧光染料PI不能进入细胞（因为PI只能进入已经破损的细胞膜）；然而，坏死或凋亡晚期的继发性坏死细胞可同时被Annexin与P ...

Hoechst-PI染色法检测细胞凋亡 亚“G1”峰方法简便，但只是代表G0/G1期发生凋亡的细胞，S期和G2期细胞凋亡发生于G1峰后，无法观察。此外，由于全部细胞均经固定，因此不能区别死细胞和活细胞。Hoechst-PI染色则可弥补上述不足。Hoechst 33258 可被活细胞摄取，与DNA结合在紫外光下呈蓝色荧光。继而PI使死细胞着染产生红色荧光。因此在细胞二维直方图上根据红蓝两种荧 ...

亚“G1”峰检测法检测细胞凋亡 处于增殖周期中的细胞，根据其所处不同周期时相（Go/G1、S、G2/M），其DNA含量分布在2n～4n之间。发生凋亡的细胞由于核内DNA裂解成许多小片段，在酒精固定后，用细胞膜通透剂使小分子量的DNA片段穿过胞膜，使细胞原有的DNA部分丢失，仅剩下大片段DNA，这些细胞在DNA染色后，用流式细胞分析术检测其DNA含量，会出现一个DNA含量＜2n（即＜G1期细 ...

凋亡细胞对胰蛋白酶和核糖核酸酶敏感性分析法如将活细胞与一定浓度的胰蛋白酶和核糖核酸酶温育，短时间内对细胞的形态、功能和活力几乎没有影响， 但坏死细胞以及细胞浆膜受到损伤的晚期凋亡细胞则可被这两种酶降解，使用流式细胞仪分析，可通过提高光散射、核酸或蛋白质荧光信号的阈值排除晚期凋亡细胞和坏死细胞，测定早期凋亡细胞。【材料与试剂】（1） 含Ca2+和Mg2+的Hanks平衡盐溶液（HB ...

PCR-SSO HLA分型技术 编码不同型别HLA抗原的基因在其碱基的顺列上存在差异，这种差异能够用序列特异性寡核苷酸探针（SSO）杂交的方法来检测。其原理是根据各种HLA等位基因的碱基序列，通过人工合成与其互补的寡核苷酸，即SSO探针；待测标本基因组DNA中的HLA基因经PCR扩增之后，与SSO探针杂交，通过观察杂交发生与否，来判断待测标本的HLA型别。 传统上PCR-SSO探针 ...

细胞凋亡的相关蛋白分析 已发现有许多基因参与调控细胞凋亡，这些基因编码的产物可参与促进或抑制细胞凋亡的发生、发展。在此主要讨论其中几种主要的细胞凋亡调节基因蛋白的特征及其检测。 起初对凋亡调节基因的研究均以一种秀丽隐杆线虫（C.elegans）为模型。大量研究表明线虫细胞死亡基因（caenorhabditis elegans cell death gene， ced gene）与此 ...