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        Hoechst-PI染色法检测细胞凋亡

        互联网

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        亚“G1 ”峰方法简便,但只是代表G0 /G1 期发生凋亡的细胞,S期和G2 期细胞凋亡发生于G1 峰后,无法观察。此外,由于全部细胞均经固定,因此不能区别死细胞和活细胞。Hoechst-PI染色则可弥补上述不足。Hoechst 33258 可被活细胞摄取,与DNA结合在紫外光下呈蓝色荧光。继而PI使死细胞着染产生红色荧光。因此在细胞二维直方图上根据红蓝两种荧光可分辨三种细胞:正常活细胞对染料有拒染性,蓝色和红色荧光均较少;凋亡细胞有膜通透性改变,主要摄取Hoechst染料,表现为强蓝色荧光,弱红色荧光;坏死细胞由于有很强的PI嗜染性并可覆盖Hoechest染色,故呈弱蓝色强红色荧光。

        【材料及试剂】

        (1)碘化丙啶(PI)贮存液:100mg/ml,4℃避光保存。

        (2)Hoechst 33258贮存液:100mg/ml,4℃避光保存。

        (3)0.01mol/L PBS pH 7.0~7.2

        【操作步骤】

        (1)常规制备单细胞悬液;

        (2)加入Hoechst 33258 溶液,使其终浓度为1mg/ml,37 ℃水溶,7分钟;

        (3)冰上冷却, 离心弃染液, PBS重悬;

        (4)加入PI染液,使其终浓度为5mg/ml,冰浴;

        (5)离心弃染液,PBS洗一次,进行流式细胞仪进行分析,、直外激光检测记录400~500nm处蓝色荧光和大于630nm处红色荧光;

        【结果判断】

        正常对照细胞呈弱蓝色及弱红色荧光;凋亡细胞呈蓝色及弱红色荧光,坏死细胞呈强红色及弱蓝色

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