• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        末端转移酶标记技术(TUNEL法)检测细胞凋亡

        互联网

        8641

        材料与试剂

        1. TUNEL试剂盒:

        ①从瓶2中取出标记液100μl分别作为两个阴性对照。

        ②将瓶1的全部溶液50μl加入瓶2剩余的450μl标记液中,使其成为500μl的TUNEL混合物。

        2. POD转换液(一旦溶解,储存于4℃,不得再冻存)

        3. 漂洗液:PBS

        4. 固定液:4%多聚甲醛(用pH7.4的PBS配)。

        5. 封闭液:0.3%H2O2 (用甲醛配)。

        6. DBA:金属增强底物剂。

        7. 细胞透化液:0.1%Trition X-100(溶于0.1%柠檬酸钠)。

        8. 蛋白酶K:10~20μg/ml,溶于Tris-HCL,pH7.6)。

        操作方法

        1、贴壁细胞、细胞甩片的染色方法

        固定:用新鲜配制的4%多聚甲醛室温固定30min;

        内源性过氧化物酶的封闭:用PBS轻洗,放入封闭液中,室温下孵育30min;

        细胞透化:用PBS轻洗玻片,滴加透化液,冰上4℃孵育2min;

        标记:PBS洗两次,将标本玻片吹干,滴加50μl TUNEL反应混合物(注意要在单层细胞上均匀分布TUNEL,为避免蒸发,将玻片置于湿盒中);同时设立对照:

        A)阴性对照:每一实验均应设立对照,每孔加50μl标记液(无末端转移酶)代替TUNEL反应混合物;

        B)阳性对照:每一实验均应设立对照,用微球核酸酶或DNA酶I处理已固定/透化的细胞(1μg~1mg/ml,室温10min),以诱导DNA链断裂。37℃孵育 30min;

        PBS洗3次;

        单个转换和分析:标本吹干,加50μl转换POD(注意要在单层细胞上均匀分布POD,为避免蒸发,将玻片置于湿盒中)37℃ 30min,PBS洗3次,加50~100μl DAB底物液,室温下孵育10min,PBS洗3次,加盖玻片;

        置于光学显微镜下观察(在光学显微镜观察前,亦可对标本进行反相染色);

        结果判断

        在光学显微镜下观察,凋亡细胞核染成棕黄色,可见核形态呈碎点状;在荧光显微镜下观察,正常细胞染成淡绿色荧光,凋亡细胞染成黄绿色荧光,凋亡细胞可见核小体。细胞玻片经过POD转换后,在光学显微镜下观察,凋亡细胞核染成棕黄色,可见核形态呈碎点状。

        2、石蜡切片的染色方法

        按常规步骤脱蜡、再水合(按HE染色的脱蜡、水合方法);

        滴加蛋白酶K于组织片上,作用30min,PBS洗2次;

        其他染色步骤见:细胞染色步骤②~⑦;

        结果分析:同上。

        3、冰冻切片的染色方法

        用4%多聚甲醛固定组织30min,PBS冲洗(注意:储存时可用无水乙醇固定组织2 min,然后存于-20℃保存);

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序