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免疫酶染色技术（ABC法）检测各类免疫细胞的数量 抗体与相应抗原结合后，形成抗原抗体复合物，然而这种复合物在显微镜下是不可见的，如将特异性抗体与酶结合，再通过适当的底物显色，就可使免疫复合物由不可见而成为可见，从而确定组织细胞是否存在某种抗原。免疫酶染色技术正是根据此原理用酶（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）标记已知抗体（或抗原），然后与组织细胞在一定条件下反应，如果组织细胞中有相应抗原或 ...

微量细胞毒试验检测各类免疫细胞的数量【基本原理】 在补体存在的情况下，针对淋巴细胞CD分子的McAb与相应的CD分子结合，可将细胞杀死，其细胞膜失去屏障作用而使伊红染料透入细胞内，使之染呈红色。而无相应CD分子的细胞则不受损伤，因而不着色。计数死亡细胞数，即可判断待检细胞是否具有相应的CD分子，从而确定T细胞的亚群。该方法简便易行，准确性较高。【试剂及材料】（1） 新鲜兔补体（ ...

MTT比色法【基本原理】 MTT法是Mosmann 1983年报道的，以后此方法得到了迅速发展并广泛应用于临床与科研研究。其原理是活细胞内线粒体脱氢酶能将四氮唑化合物（MTT）由黄色还原为蓝黑色的甲肷，甲肷的生成量与细胞的增殖程度呈正相关。后者溶于有机溶剂（如二甲亚枫或酸化异丙醇等），并可在560nm波长下进行检测。【试剂及材料】（1） MTT：用PBS配成5mg/ml的 ...

T、B淋巴细胞功能测定 淋巴细胞功能测定可分为体内试验和体外试验。体内主要是进行迟发型超敏反应，借此间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分裂原的反应；体外试验方法包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原的增殖试验、细胞毒试验以及其分泌产物功能的测定（淋巴因子的测定见第八章）。淋巴细胞功能测定不仅能够了解机体免疫功能状态，而且是免疫缺陷病诊断的主要依据，也有助于探讨某些疾病的发病机理、疗效判断、推断转 ...

XTT比色法【基本原理】 XTT比色法有Scudiero等首次采用，用于检测细胞增殖。XTT是异种与MTT类似的四唑氮衍生物，可被活细胞线粒体脱氢酶还原成水溶性的棕色甲肷产物，当XTT与电子偶合剂共同使用时，甲肷的生成量与细胞的增殖程度呈正相关。【试剂及材料】（1） XTT：用60℃预热培养液配制成6.6mmol/L，过滤除菌，现配现用。（2） 吩嗪二甲酯 ...

3H-TdR掺入试验【基本原理】淋巴细胞受特异性抗原或有丝分裂原刺激后，在转化为淋巴母细胞的过程中，DNA的合成明显增加。且其转化程度与DNA的合成呈正相关，此时若将合成DNA的前体物质胸腺嘧啶核苷用放射性同位素（3H -TdR）标记，加入到培养体系中，即被转化的淋巴细胞摄取而掺入DNA分子内。培养终止后，测定淋巴细胞内掺入的3H -TdR的放射量，就能判断淋巴细胞的转化程度。此方法较客观、精确 ...

MHC/多肽四聚体法检测抗原特异性T细胞数量T细胞通过其表面TCR特异性识别抗原呈递细胞表面的MHC/抗原肽复合物后，被活化和发生增殖，进而分化成效应细胞。因此，可以用MHC/抗原肽复合物检测T细胞表面的特异性TCR，来反映抗原特异性T细胞数量的变化。 Altman等首次发明MHC/多肽四聚体方法并应用于检测可识别HIV抗原肽的特异性CTLs，获得成功。后经Walter等改进，成为检测和 ...

抗CD3 McAb诱导的细胞毒性T细胞功能的检测【试剂及材料】 （1） 靶细胞：EB病毒转化的B淋巴母细胞。（2） 含5％NCS的RPMI-1640完全培养液（3） 100μCi/ml 51Cr（4） 抗CD3 McAb（4μg/ml）（5） 2％Triton X-100。【操作方法】（1） 靶细胞 ...

单向混合淋巴细胞培养【试剂及材料】（1） 供者和受者淋巴细胞悬液：浓度调至1×106/ml。（2） 丝裂霉素C：用培养液或PBS配制300μg/ml。（3） 含20％NCS的RPMI-1640完全培养液（4） 3H-TdR【操作方法】（1）刺激细胞的制备:取淋巴细胞1×106，加入最终浓度为30μg/ml的丝裂霉素C，于37℃水浴 ...

特异性抗原诱导的细胞毒性T细胞功能测定【基本原理】 本方法先借助长期混合淋巴细胞培养法获得抗原特异性CTL，然后再进行细胞毒试验。其原理为：外周血淋巴细胞包含针对不同抗原的特异性CTL克隆，在体外经某一特定（或同种异体细胞）抗原刺激后，能识别该抗原的T细胞克隆被选择性激活、增殖，而其他T细胞克隆则逐渐死亡；经3~4次刺激后，存活的均为识别特异性MHC/抗原肽复合物的细胞，即抗原特异性CTL ...

抗TCR介导的CTL活性酯酶分析法 细胞毒性T细胞对靶细胞杀伤的主要机制是通过释放的穿孔素-颗粒酶系统介导的溶靶细胞作用或通过fas/fasL系统介导的细胞凋亡作用。因此，对CTL颗粒酶的胞泌作用分析可反映细胞毒性T细胞功能。该方法操作简便且无需靶细胞作为指示细胞。【基本原理】应用直接针对TCR的单克隆抗体，模拟特异性靶细胞的作用，诱导CTL细胞内颗粒丝氨酸酯酶等的释放。抗TCR可与C ...

佛波酯（phorbol esters）和钙离子载体诱导的CTL颗粒酶释放分析法【基本原理】 用佛波酯（phorbol esters）和钙离子载体处理CTL，通过一种TCR复合物非依赖性机制，刺激CTL细胞颗粒酶的胞泌作用。【试剂及材料】（1） 1mg/ml十四酰佛波乙酸酯（phorbol myristate acetate，PMA）二甲亚砜溶液。（2） 1m ...

常用蛋白酶蛋 白 酶分 类作 用 位 点已知抑制物氨基肽酶金属蛋白酶带有自由氨基的L-氨基酸氨基末端；不能分解由X-Pro、-D或-Q组成的肽键2，2�双吡啶，1，10-菲咯啉菠箩蛋白酶巯基蛋白酶无特异性a2巨球蛋白，TPCK TLCK 烷化剂羧肽酶A锌金属蛋白酶带有自由氨基酸的L-氨基酸羧基端；不能分解R、P或羟脯氨酸EDTA EGTA羧肽酶B锌金属蛋白酶KR羧基端EDTA EGTA碱性氨基酸 ...

常用蛋白酶抑制剂抑制剂靶蛋白酶有效浓度储藏溶液注解Antipain木瓜酶和胰酶50μg/ml1mg/ml水溶液对胰凝蛋白酶，胃液素，纤溶酶无影响APMSF胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶10-40μg/ml或10-20μM100mmol/L水溶液毒性比PMSF低，不能抑制胰凝蛋白酶或乙酰胆碱酯酶抑肽酶丝氨酸蛋白酶0.06-2μg/ml10mg/mlPBS溶液避免反复动冻融抑氨肽酶B氨基肽酶40μg/ml溶 ...

反向空斑形成试验（RHPA）【基本原理】 反向空斑形成试验（reversed hemolytic plaque assay，RHPA）是一种体外检测人类Ig分泌细胞的方法。该法将待检人的PBMC或组织来源的淋巴细胞（如扁桃体、脾细胞等）、SPA致敏的羊红细胞（SPA-SRBC）、抗人Ig抗体及补体4种成分混合，注入由两张玻片制成的小室内，密封小室，37℃温育3～5h。此时抗人IgG抗体的F ...

靶细胞诱导的CTL细胞颗粒酶胞泌作用【基本原理】 该法通过抗原（靶细胞）刺激CTL的TCR，从而活化CTL。其特点是，可定量测定CTL-靶细胞特异性的相互作用，这种靶细胞诱导的CTL细胞颗粒酶胞泌作用，也可通过测定效应细胞或靶细胞的表面分子作为辅助指标。【试剂及材料】（1） 特异性靶细胞，其表面携带CTL所识别的抗原；（2） 其余材料见方法1（抗TCR介导 ...

BA-Spot-ELISA法检测抗体形成细胞【试剂及配制】（1） 包被液（pH 9.6 碳酸盐缓冲液）Na2CO3 0.16gNaHCO3 0.29g蒸馏水加至 100ml（2） 洗涤液（pH 7.4 PBS-Tween 20） KH2PO4 0.2g Na2HPO4・12H20

配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶所用溶液溶液成分不同体积(ml)凝胶液中各成分所需体积(ml)5101520253040506%水2.65.37.910.613.215.921.226.530%丙烯酰胺溶液1.02.03.04.05.06.08.010.01.5mol/L Tris-HCl，pH 8.81.32.53.85.06.37.510.012.510%（ ...

配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶所用溶液溶液成分不同体积(ml)凝胶液中各成分所需体积(ml)123456819浓缩胶水0.681.42.12.73.44.15.56.830%丙烯酰胺溶液0.170.330.50.670.831.01.31.71.0mol/L Tris-HCl，pH 6.80.130.250.380.50.630.751.01.2510%（w/ ...

实验用小鼠的品系实验用小鼠的品系品 系缩 写毛 色MHC-II类基因单体型注 释A/JA白色kAKRAK白色kBALB/CC白色d多数患骨髓瘤的亲代为异基因CBACB野鼠色kC3HC3野鼠色kC57BL/6B6黑色b常用做转基因F2的亲代C57BL/10B10黑色b多数H2是同基因DBA/2淡褐色d常用做转基因F2的亲代NZB黑色d适合制作抗自身抗体SJL白色s常用做转基因F2的 ...