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        反向空斑形成试验(RHPA)

        互联网

        9045

        一、基本原理

        反向空斑形成试验(reversed hemolytic plaque assay,RHPA)是一种体外检测人类Ig分泌细胞的方法。该法将待检人的PBMC或组织来源的淋巴细胞(如扁桃体、脾细胞等)、SPA致敏的羊红细胞(SPA-SRBC)、抗人Ig抗体及补体4种成分混合,注入由两张玻片制成的小室内,密封小室,37℃温育3~5h。

        此时抗人IgG抗体的Fc段与SPA-SRBC结合,抗体形成细胞分泌的IgG与抗人IgG结合后,活化补体,介导SPA-SRBC的溶解。在分泌Ig的细胞周围形成园形的溶血区,称为溶血空斑。每一个溶血空斑即代表一个Ig分泌细胞。

        二、试剂及材料

        1. 1:2 SRBC/阿氏液

        2. SPA

        3. 豚鼠补体

        4. 多克隆兔抗人Ig(56℃,30min灭活)

        5. 多克隆诱导剂

        三、操作方法

        1. 抗体分泌细胞的诱导:

        ①将分离的PBMC或B细胞用含5%NCS的RPMI-1640培养液洗涤3次,每次1000r/min离心10min,以除去外源Ig;

        ②用含10%NCS的RPMI-1640培养液调整细胞浓度至1×105 /ml,接种24孔细胞培养板,1ml/孔;

        ③每孔加入适当稀释的多克隆刺激剂20μl(如PWM溶液终浓度为1:100),并设未加刺激剂的空白对照孔;

        ④将培养板置37℃,5%CO2 温箱培养10d后待测。

        2. SPA致敏SRBC:

        ①SRBC/阿氏液(1:2)悬液用生理盐水洗涤3次,每次1200r/min离心10min;

        ②将沉淀细胞1800r/min离心10min,弃上层淡黄色液体,沉淀SRBC备用;

        ③将SPA 5mg溶于5ml生理盐水中;

        ④将CrCl3 溶于5ml生理盐水中(配制后必须在10min内使用;

        ⑤分别取10.4ml生理盐水、0.1ml CrCl3、0.5ml SPA和1.0ml SRBC,加至离心管内,加盖,混匀,37℃温育1h,其间振摇3~4次;

        ⑥将致敏SRBC用生理盐水洗涤3次,每次1200r/min离心10min,加入平衡盐溶液,4℃保存备用(不超过一周)。

        3. 补体的处理:

        ①取抗凝羊血15ml用冷PBS洗涤3次,每次1200r/min离心10min(4℃),弃上清;

        ②将SRBC用4倍体积的冷PBS洗涤一次,4℃下1800r/min离心10min;

        ③将SRBC与豚鼠补体按1:4(V/V)混合,4℃作用2h后,4℃下1800r/min离心10min,收集上清即SRBC吸收为处理过的补体,分装后,置-20℃保存备用。

        4. 抗血清的处理:

        将鼠抗人Ig与冷PBS洗涤沉淀的SRBC按1:2(V/V)混合,置4℃作用2h后,4℃下1800r/min离心10min,收集上清分装,-20℃保存备用。

        5. 空斑形成及计数:

        ①抗体分泌细胞的制备:将诱导培养的细胞或新鲜分离的PBMC或淋巴细胞用RPMI-1640洗涤3次,每次1200r/min离心10min,弃上清后,沉淀细胞用洗液调至所需浓度;

        ②空斑混合液的配制:将致敏的SPA-SRBC、补体和抗Ig抗体按等体积混合均匀;

        ③分别取75μl空斑混合液和125μl细胞悬液加入微量平底板孔中,用毛细吸管充分混匀,注意不要形成气泡;

        ④用微量进样器将混悬细胞转至已准备好的两张玻片制备的小室中,每室约50μl,每份样品设复孔;

        ⑤用毛细吸管加入温热的石蜡-凡士林混合液封闭小室;

        ⑥将密封后的小室置37℃温育3~5h后,在显微镜下(10×)或半自动空斑计数器上计数空斑形成细胞。

        四、注意事项

        1. 不同的抗体检测方法,要求的培养时间不同。ELISA法一般培养7d左右,而反向溶血空斑法和ELISPOT则需培养10d。

        2. ELISA是检测诱导细胞培养上清中的抗体,而反向溶血空斑法和ELISPOT是检测分泌抗体的细胞。

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