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制备单克隆抗体杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化培养 1、杂交瘤阳性克隆的筛选 杂交瘤细胞在HAT培养液中生长形成克隆后，其中仅少数是分泌预定特异性McAb的细胞，而且多数培养孔中有多个克隆生长，分泌的抗体也可能不同，因此，必须进行筛选和克隆化。常用方法有酶联免疫吸附试验(ELISA)，间接血凝试验(PHA)，放射免疫测定(RIA)、直接和间接荧光抗体技术(DFA、IFA)以及免疫酶斑点试验 ...

McAb的制备方法 1、体外培养 在细胞培养过程中杂交瘤细胞能产生和分泌McAb，但是一般产生的抗体量很少，约10～100μg/ml。近年来发展了各种新型培养技术和装置，包括用无血清培养液作悬浮培养法，中空纤维培养系统，全自动气升式或深层培养罐以及微囊或粒珠培养系统等。为了大批量生产McAb，有的公司已建成体内外结合的牛淋巴液循环法，大大提高了抗体的生产量。 2、体内诱生 ...

基因工程抗体技术 以McAb作为载体，荷载同位素、药物或毒素蛋白在肿瘤的治疗上具有巨大的潜力。但由于鼠源性McAb的应用存在三个障碍： ①鼠源性McAb对人体有较强的免疫原性，可产生人抗鼠抗体(HAMA)； ②注入人体的McAb在肿瘤部位的摄取量甚少； ③生产成本高，难以普及。人－人杂交瘤技术还存在难以克服的困难，为了冲破这些障碍，基因工程抗体应运而生，并得以蓬勃发展 ...

人-鼠嵌合抗体 人-鼠嵌合抗体，即抗体的可变区来自小(大)鼠McAb，而恒定区则来自人的抗体。这样的抗体既保持了原来McAb的特异性和亲和力，又大大减少了在人体内的免疫原性。要生产这样的嵌合抗体，第一步也是关键的一步是要从杂交瘤细胞中获得McAb的特定可变区基因，然后再与人的抗体恒定区基因连接，最后将构建好的人-鼠嵌合抗体基因导入骨髓瘤细胞中表达。主要步骤包括制备目的基因、选择载体、将目 ...

嵌合基因的构建（RT-PCR方法扩增VL、VH基因）【材料和试剂】(1) 分泌McAb的杂交瘤细胞(如分泌抗转铁蛋白受体的杂交瘤细胞株)。(2) 细胞培养常用试剂、培养液、器皿。(3) 总RNA提取试剂 Trizol Reagenz。(4) cDNA合成试剂盒。(5) DNA提取试剂及分子生物学技术所需其他试剂和溶液。(6) 核酸修饰酶类：T4DNA连接酶、TaqDNA聚 ...

抗体的轻、重链嵌合基因共转染受体细胞目前将重组子导入宿主细胞主要采用的方法有磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖街道法介导法、聚季铵盐介导法、原生质体融合法、电转染法以及微注射法。其中以电转染效率较高。【材料和试剂】（1） 小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0细胞或P3X63.Ag8.653细胞，或CHO细胞。（2） 已构建的轻、重链嵌合基因质粒DNA。（3） 脂质体。（4） ...

小分子抗体的类型及优点 小分子抗体包括：Fab(由完整的轻链和Fd构成)，Fv(由VH和VL构成)，ScFv(单链抗体，VH和VL之间由一连接肽连接而成)，单域抗体(仅由VH组成)，最小识别单位(MRU，由一个CDR组成)以及超变区多肽、双链抗体、三链抗体、微型抗体等几种类型。小分子抗体的优点是比较明显的： 1. 制备方法较其他基因工程抗体简单。 2.免疫原性要比原来的M ...

ScFv表达载体pFUW80的基因图谱 由于单链抗体可以在大肠杆菌中正确装配、表达，而抗体片段在大肠杆菌中的表达具有规模大、速度快和成本低的优点，目前主要利用原核的大肠杆菌表达载体表达单链抗体。 单链抗体基因的设计应设计理想的连接序列(linker)，以保证VH和VL在表达系统中能等摩尔地产生，不干扰VH和VL的自由折叠，并使抗原结合位点处于适当构型，不引起分子动力学改变，尽可能 ...

单链抗体的构建 【材料和试剂】 （1）杂交瘤细胞株。 （2）大肠杆菌菌株JM109，此菌含有LacIq、LacZ、M15，可进行α-互补试验检测重组子。 （3）克隆质粒pUC19及表达载体质粒pFUW80(有关pFUW80的性质、特点及物理图谱，详见本章其他部分)。 （4）引物。 （5）主要试剂：包括杂交瘤培养、RNA提取、PCR扩增所用试剂及cDNA合成试剂 ...

抗人肺腺癌单链抗体的构建 (1)将表达载体pFUW80质粒经XbaI和EcoRI双酶切，同样双酶切在pUC19中克隆的VL基因，分别回收后，连接并转化大肠杆菌JM109株，鉴定阳性重组子(可通过XbaI、EcoRI双酶切切下合适大小的带，即VL片段)。 (2)将上述经过鉴定的重组质粒用XhoI、SpeI双酶切，回收后，与同样双酶切的在pUC19中克隆的VH基因相连，再次转化JM10 ...

抗体库技术 抗体库技术的主导思想是将某种动物的所有抗体可变区基因克隆在质粒或噬菌体中表达，利用不同的抗原筛选出携带特异抗体基因的克隆，从而获得相应的特异性抗体。 从抗体库中筛选多种重要的抗体，如膜蛋白抗原、自身抗原、病毒抗原的抗体。这些显示出抗体库技术的应用潜力。 抗体库技术不仅可以模拟动物免疫系统产生抗体的过程，还具有许多独特的优点，令杂交瘤技术难以相比。抗体库技术无需免 ...

基因工程抗体的表达 基因工程抗体的表达主要问题是选择适当的宿主和表达载体的设计，这是获得高亲和力抗体的重要前提。目前，广泛用于研究抗体表达的宿主系统是大肠杆菌和哺乳动物细胞，最近在植物中表达抗体成为抗体研究的热点。表达抗体的纯化手段当前发展为金属螯合层析(IMAC)，其特点为快速简便，效率及纯度都很高。抗体的活性测定除采用常规方法外，可用间接方法如免疫竞争抑制等，可测定因缺少恒定区的小分 ...

基因工程抗体细胞质表达 胞内表达抗体主要采用高表达方式，其表达结果因抗体片段的不同而有较大差异，主要取决于翻译起始位点的设计、片段对蛋白酶的敏感性和宿主菌。高表达抗体的结果常常是以包涵体(inclusion body)形式存在，除载体方面的原因外，这可能与抗体表面疏水性强有关。包涵体可以防止宿主对抗体的降解，并利于纯化。经过变性、复性及去除蛋白的N端甲酰甲硫氨酸或甲硫氨酸，可以得到重新折 ...

基因工程抗体分泌型表达 在表达载体上装入信号肽序列，可以使抗体片段分泌到细胞外或周质腔。在表达时抗体完成切断信号肽，蛋白质折叠，二硫键形成，重、轻链的正确装配等一系列过程，能形成有活性的抗体分子。信号肽可利用已知的PelB以及碱性磷酸酶(PhoA)；外膜蛋白A(OmpA)；A-溶血素蛋白(HlyA)等，将抗体基因两条链分别融合到一种或两种信号肽后面，或者同时融合到同一种信号肽后面。融 ...

基因工程抗体抗体的纯化 对于表达的抗体需要纯化才能准确地进行活性、亲和力的鉴定及应用于临床研究。基因工程抗体的纯化方法与通常抗体纯化方法基本相同。本文主要介绍利用IMAC方法纯化。IMAC的方法原理是利用组氨酸的咪唑基能与二价金属离子，如Cu2+、Zn2+、Ni2+等发生螯合作用，在表达载体的抗体基因插入位点后面设计5～6个组氨酸，这并不影响抗体正确折叠成活性分子，经过一步洗脱，得到 ...

影响免疫亲和层析纯化效果的因素 多种因素影响免疫亲和层析纯化效果，其中最关键的三个因素是：抗原的初始纯度，抗原与抗体的亲和力，以及抗原抗体结合是否容易发生解离。 在免疫亲和层析技术中，抗原的初始相对浓度（即纯度）是决定最终产物纯度极为重要的因素，因为抗原-抗体的反应具有相当高的特异性，还没有任何其他一种层析技术能经过一步纯化得到如此高的纯度。然而，纯化的程度不是无限的，免疫亲和层析 ...

免疫亲和层析使用的抗体的选择 通过实验比较和经验积累才能发现最适合用于免疫亲和层析的抗体（见表2-1）。这意味着没有轻而易举的捷径能选择到最佳的抗体，最好的方法就是进行预实验，来初步测试这些抗体的效果。可用不同的共价交联微珠进行免疫沉淀试验，然后通过免疫印迹法测定结合的抗原量；另一种方法是将抗原溶液通过小型层析柱，然后用免疫印迹的样品缓冲液进行洗脱。一旦确定与抗原结合性能良好的抗体后，下一 ...

多克隆抗体和单克隆抗体的比较 免疫亲和层析技术使用单克隆抗体或经过亲和层析纯化的多克隆抗体。在某些情况下，可用未纯化的多克隆抗体，但一般不使用混合的单克隆抗体。1、应用多克隆抗体进行免疫亲和层析 使用多克隆抗体进行免疫亲和层析有一定的局限性，因为多克隆抗体通常结合抗原分子上的多个表位，虽然亲合力高，但洗脱困难。当一种抗原与多种不同的抗体结合后，需要很苛刻的洗脱条件，通常会损坏抗体层 ...

免疫亲和层析的基本过程一．概要 对蛋白质（抗原）的纯化率为1000~10000倍 快速纯化抗原，层析柱一般可重复使用 可获得纯化的抗原 不能用于定量测定 纯化效果取决于待纯化抗原的浓度和抗体的亲和力 需要适当纯化的抗体二．操作步骤　基本步骤为：交联 → 结合 → 洗脱（一）交联 1.将抗体结合到蛋白A或蛋白G微珠上。一般情况下，每毫升湿的微珠大约可以结合2mg单 ...

免疫亲和层析技术 亲和层析技术是纯化各种生物大分子的有效方法。最初是将抗体作为一种结合剂用于免疫亲和层析，根据抗原抗体结合后形成大量多聚体和不溶性基质原理来收集抗原。随后，利用抗体与惰性微珠共价交联虽然这种反应是一种简单的结合，但抗体的活性因交联缺乏定位作用或抗体的过量交联而丧失。通过研究发现，抗体与蛋白A或蛋白G微珠共价交联后更容易与抗原结合。将具有良好抗原结合特性，且来源广泛的各种单克 ...