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4小时51Cr释放法检测CMC活性 1）用51Cr铬酸钠标记靶细胞 短期标记法 1．用RPMI-1640培养液洗涤107靶细胞，去上清液。用0.5ml不含碳酸氢钠的完全培养液悬浮细胞。加入100μCi（3.7MBq）51Cr铬酸钠，37℃水浴中标记1小时，每5～10分钟摇晃一次，混匀细胞。 2．如上用RPMI-1640培养液洗涤细胞3次，每次400×g 10分钟。用50ml RPMI-1640培养 ...

一、实验目的 　　1 以分离叶绿体为例，掌握离心机的操作技术；　　2 通过光镜鉴定叶绿体的纯度及了解叶绿体形状；二、离心技术概述　　离心技术（centrifugal technique）是根据颗粒在作匀速圆周运动时都会受到一个向外的力而发展起来的一种分离技术。（一）基本原理 离心力和相对离心力　　1． 离心力（centrifugal force，Fc）是颗粒在一定角度速度下作圆周运动受到一个向外的 ...

1）结晶紫检测法1．在96孔细胞培养板各孔中加0.1ml含5×104～10×4 WEHI-164细胞的培养液（含10％小牛血清的RPMI-1640培养液），37℃ 5％ CO2的二氧化碳培养箱中培养2～3小时，让细胞帖壁。2．用RPMI-1640培养液10倍递次稀释TNF标准品，根据需要3～5倍递次稀释待检样品，每孔加0.1ml稀释的标准品或待检样品，每个稀释度3个重复孔。对照孔6个，3个阳性对照 ...

H脱氧胸苷释放法1）标记靶细胞1．用含5％小牛血清的RPMI-1640培养液将靶细胞配成2×106/ml，取10μCi（370kBq）HTdR加到1ml靶细胞中，37℃水浴标记4～6小时，每30分钟摇晃一次。2．用RPMI-1640培养液洗涤细胞3次，每次400×g 10分钟。用含5％小牛血清的RPMI-1640培养液将细胞浓度调整为1×105/ml备用。2）HTdR释放实验1．在96孔圆底细胞培 ...

一、实验目的　　　1.了解绿色荧光蛋白和共聚焦扫描显微镜在细胞分子生物学中的应用　　2.学会使用质膜蛋白的分析软件。二、带GFP的质膜蛋白分选概述1．质膜蛋白的跨膜信号　　在粗面内质网上合成的蛋白质有两类：分泌蛋白和膜蛋白，分泌蛋白在内质网上合成之后通过多种信号切除后释放到内质网的腔中，进行下游途径的转运。膜蛋白较为复杂，它要靠疏水区滞留在内质网膜上。下面以酵母二价铁的转运蛋白（IRT）为例来说明 ...

　　人巨噬细胞可从外周血或经斑蝥激发的皮疱液中获取，也可从肺灌洗液或患者腹膜透析液中分离，但操作繁锁，得量不多。许多实验室在进行基础或配合临床研究巨噬细胞功能及其与疾病的关系、或筛检免疫增强药物和探讨其作用机制时，常选用小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象，常用的检测方法如下。 　　（一）炭粒廓清试验 　　正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90％炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除10％炭粒，据此给小鼠定量静脉注射印度墨 ...

用MTT检测法测定CMC1． Fen细胞培养于含10％小牛血清的RPMI-1640培养液中，在25cm2培养瓶中生长到接近汇合。用含0.05％胰蛋白酶，0.02％ EDTA的PBS消化细胞5分钟，洗涤后，用细胞培养液将细胞配成1×105/ml。2． 取96孔细胞培养板，每孔加0.1ml细胞悬液，在37℃ 5％ CO2的饱和水汽二氧化碳培 养箱中培养24小时，让细胞帖壁。每孔加0.1ml效应细胞悬液 ...

一、普通光学显微镜观察方法 1）苏木素－伊红染色（HE染色法） 石蜡组织切片的HE染色 1．取材组织块，经固定后，常规石蜡包埋，4μm切片。 2．切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗：二甲苯（I）5min→二甲苯（Ⅱ）5min→100％乙醇2min→95％的乙醇1min→80％乙醇1min→75％乙醇1min→蒸馏水洗2min。 3．苏木素染色5min，自来水冲洗。 4．盐酸乙醇分化30s（提插 ...

东南大学附属中大医院麻醉科 汪福洲 景亮 南京210009巨噬细胞移动抑制因子（MIF）作为一种多能细胞调节蛋白，是与多种疾病有着密切关系的“新型分子”。尽管最初因MIF能够抑制豚鼠巨噬细胞随机移动而得名，但随着MIF在机体生命活动中一系列生理及病理生理作用的相继确认，已激起了对其在体内多种疾病病理过程中重要调节作用的高度关注。现今认为，MIF是集细胞因子、神经内分泌激素和酶特性于一身的多效能蛋白 ...

1）分离外周血中的单个核细胞（PBMC） 1．抽取正常人静脉血加到肝素抗凝管中，加等量含5～10IU/ml肝素的无血清缓冲液悬浮细胞。将细胞悬液小心加在与血液等量的淋巴细胞分离液上，室温中，水平离心500×g 20分钟。此时离心管中形成5层：最上面是血浆，血浆层和淋巴细胞分离液之间是PBMC，淋巴细胞分离液层和最下面的红细胞层之间是粒细胞层，又成为棕黃层。 2．吸去最上层的血浆，收集血浆层和淋巴细 ...

1）研究细胞因子mRNA的方法 绝大多数细胞因子mRNA在T细胞中只短暂存在，其存在的量与T细胞产生细胞因子的量也有很好的相关性。所以，在大多数情况下，细胞内mRNA的量可以反映细胞产生细胞因子的情况。 检测细胞因子mRNA的试验主要有：竞争性聚合酶链反应、Northern印迹杂交、斑点杂交、逆转录聚合酶链反应、原位杂交。 2）研究细胞因子的免疫检测法 免疫检测法主要有放射免疫检测法、酶免疫测 ...

摘要　脂多糖（LPS）通过与膜受体CD14作用将信号从胞外传到胞核而刺激多种细胞合成和释放TNF-α、IL-１和IL-6等生物活性物质而表现复杂的生物学活性，但其详细机制尚未完全清楚。本文就近年来对LPS激活巨噬细胞的信号传导机制的研究作一简要综述。　　关键词:内毒素；信号传导；内毒素结合蛋白；蛋白酪氨酸激酶　　内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁的组成成份，其化学本质为脂多糖，为细菌死亡或活 ...

1）原位缺口翻译检测裂解的DNA片段1．取106经促调亡物质处理的细胞，用1％ BSA-PBS洗涤细胞后加入0.1ml FITC标记的抗CD4或抗CD8单克隆抗体，4℃ 20分钟。用1％ BSA-PBS洗涤细胞。置冰上。2．加入0.1ml 1％多聚甲醛，置冰上5分钟，加入60％（v/v）甲醇溶液，轻轻悬浮细胞，4℃固定细胞15分钟。4℃离心500×g 10分钟，去上清液。3．加入0.1ml 0.1 ...

1）用玫瑰花结形成试验分离E＋细胞1．制备AET-绵羊红细胞1）在刻度离心管中，用无菌的含5％小牛血清的Hanks液洗涤绵羊红细胞3次，每次离心500×g 10分钟。2）吸净上清液，测量红细胞比容。轻击试管分散红细胞，加入4倍红细胞比容量、新鲜制备的AET溶液，混匀。室温中反应30分钟。3）用无菌的含5％小牛血清的Hanks液洗涤AET-绵羊红细胞5次，每次离心500×g，10分钟。用含10％小牛 ...

1．细胞以1.5×105/ml细胞数接种于直径35ml培养皿中（内放置一盖玻片），培养1天，用含0.4％ FCS培养液同步化3天，使绝大多数细胞处于G0期。 2．终止细胞培养前，加入BrdU（终浓度为30μg/L），37℃，孵育40min。 3．弃培养液，玻片用PBS洗涤3次。 4．甲醇/醋酸固定10min。 5．经固定的玻片空气干燥，0.3％H2O2-甲醇30min灭活内源性氧化酶。 6．5％正 ...

1．用细胞培养液等量混合效应细胞和靶细胞，30℃水浴10分钟。室温中250×g离心5分钟，去上清液。同量靶细胞不加效应细胞同样处理作为对照。 2．用少量细胞培养液轻轻悬浮细胞，吸管上下吹打5～6次。这一分散细胞的步骤关系到试验的准确性和重复性，应当设法保持技术的一致性。取少许细胞悬液，稀释后直接在显微镜下计数效应细胞和靶细胞的结合率，即平均每100各淋巴细胞中结合了靶细胞的效应细胞的数目。 3．其 ...

1）从小鼠、豚鼠或家兔腹腔中分离巨噬细胞 1．取6周左右的小鼠（或600克左右的豚鼠，或3公斤左右的家兔），剃去腹部的毛并消毒。腹腔注射1ml（豚鼠20ml，家兔200ml）无菌的液体石蜡或巯基乙酸肉汤或4％淀粉肉汤。3～4天以后收集腹腔细胞。 2．如要收集腹腔静置巨噬细胞，不注射刺激物，直接从这一步开始。放血处死动物，以减少腹腔中的红细胞。消毒腹部，沿腹中线注入3～4ml（豚鼠20～40ml，家 ...

1．体外细胞培养结束后，去培养液，加入11％的戊二醛固定，置于振荡器上摇20min。 2．固定细胞用去离子水洗涤至戊二醛液洗净。 3．置空气或烘箱37℃彻底干燥。 4．加入0.1％的结晶紫液对细胞染色，振摇30min。 5．用蒸馏水洗涤，至多余的结晶紫液冲洗干净。 6．置空气或37℃烘箱中彻底干燥。 7．加入10％的乙酸对细胞吸收的结晶紫进行提取。 8．1h后在酶标仪上测定光吸收度，波长595nm ...

1．血液制备：柠檬酸（Citric Acide）或肝素抗凝取血1～2ml，分装入管中，每管0.5ml全血，置于4℃冰箱中30分钟。 2．EBV病毒转化：从液氮中取出冻存的0.5ml全血，在37℃水中迅速解冻。 3．将解冻细胞与10ml不含血清的RPMI 1640混合，2500 rpm离心2分钟，弃上清，用含20％的胎牛血清、青、链霉素和庆大霉素的RPMI 1640生长培养基重悬细胞。 4．加入0. ...

1．96孔细胞培养板中培养细胞，去培养液。用0.01mol/L PBS洗涤1次（如为悬浮细胞则用离心洗涤）。 2．去洗涤液后加入磷酸酶底物100μl/孔。 3．37℃，孵育1～4h。 4．加入0.1mol/L氢氧化钠10μl/孔。 5．在多孔酶标仪上405nm处测光吸收度，将细胞培养板其中不含细胞，同样处理过的一孔作为空白对照，所测的每孔光吸收度可间接反应每孔中的细胞数。如在同样条件下作一细胞数的 ...