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        从单个核细胞中分离出T细胞

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        1)用玫瑰花结形成试验分离E+细胞
        1.制备AET-绵羊红细胞
        1)在刻度离心管中,用无菌的含5%小牛血清的Hanks液洗涤绵羊红细胞3次,每次离心500×g 10分钟。
        2)吸净上清液,测量红细胞比容。轻击试管分散红细胞,加入4倍红细胞比容量、新鲜制备的AET溶液,混匀。室温中反应30分钟。
        3)用无菌的含5%小牛血清的Hanks液洗涤AET-绵羊红细胞5次,每次离心500×g,10分钟。用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液将细胞悬浮至10%(v/v)浓度。10% AET-绵羊红细胞悬液可在4℃保存三周。
        2.用玫瑰花结形成试验分离E+细胞(Ficoll分离法)
        1)用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液将单个核细胞悬浮至107/ml,加入1/10~1/20量的10% AET-绵羊红细胞悬液。混合后,室温放置1小时。离心500×g 10分钟,4℃过夜。
        2)吸去上清液,用手轻轻旋转离心管,使细胞悬浮,不要用吸管吹打。加入同样培养液至原容量。
        3)将细胞悬液小心加在半量淋巴细胞分离液上,室温中水平离心500×g 20分钟。
        4)吸弃上层无细胞液体,将 细胞培养 液和淋巴细胞分离液交界面的细胞和约85%的淋巴细胞分离液吸出,置另一离心管中。交界面的即E-细胞,立即向该细胞悬液中加等量洗涤液,离心500×g 10分钟,去上清液;再用洗涤液同样洗涤2次,除去淋巴细胞分离液,以备进一步分离B淋巴细胞和单核细胞。

        5)分离E+细胞:吸出剩余液体,用10倍量Gey’s液悬浮沉淀细胞1~2分钟,低渗溶解红细胞。立即加入同量两倍浓缩的PBS,恢复等渗。离心500×g 10分钟,去上清液。再用RPMI-1640培养液同样洗涤2次。此即E+细胞。用1%台盼蓝染色法测定细胞浓度和细胞活力,用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液将细胞悬浮至适当浓度。
        3.用玫瑰花结形成试验分离E+细胞(Percoll分离法)
        制备Percoll密度梯度
        1)将1份10倍浓缩的PBS与9份Percoll混合,得到等渗的Percoll溶液,比重应是1.127。
        2)稀释液(含25mmol/L Hepes, 10%小牛血清的RPMI-1640培养液)的比重约1.008左右。按下式配制不同比重的Percoll溶液: % Percoll=(所需比重-稀释液比重)/(等渗Percoll溶液比重-稀释液比重)×100
        分离E+细胞
        1)取10ml 5×106/ml的单个核细胞置离心管中,加2.5ml 10% AET-绵羊红细胞和1ml小牛血清,混合后,20℃离心200×g 15分钟,确定没有悬浮的红细胞,冰浴60分钟或过夜。

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