全部

人外周血PBMC的制备流程收集抗凝人外周血，用 1640 无血清培养基或 PBS 按照 1:1 的比例稀释，上下颠倒混匀或者用移液枪吹打混匀。在 15 mL 离心管中，先加入 3 mL 充分混匀的 Ficoll 液（1.077 g/mL），再沿着管壁缓慢加入2 mL稀释后的血液，血液和 Ficoll 液分层明显为成功。注：Ficoll 提前半小时从 4℃ 冰箱取出恢复到室温，温度过高会导致分离不明显，温度过低会导致密度过大，同样分离效果不好， 20~25℃ 最佳。。将样本小心转移到离心机，500 g 离心 25 min。小心取出离心管，吸取中间层的白色薄膜层，即为单个核细胞。用 10 mL PBS 洗涤获得的单个核细胞，250g 离心 10 min，弃上清。重复洗涤一次。用细胞染色缓冲液重悬细胞备用。注意事项：Ficoll 使用时的温度很重要，温度太高或者太低都会影响分离效果。血液样本最好为新鲜抗凝血（采血 2 h 以内），为保持细胞活力，应避免冷冻和冷藏。3.50 mL 离心管离心效率比 15 mL 离心管差，为了获得最大量的单核细胞，最好用15 mL离心管，且离心管使用量不要超过三

小鼠腹水及单细胞悬液制备流程配制 6% 淀粉肉汤。6% 淀粉肉汤配制方法：牛肉膏 0.3g、蛋白胨 1.0g、氯化钠 0.5g、蒸馏水 100mL，上述材料混合加热后加入可溶性淀粉 6.0g；溶解后，121℃ 高压灭菌 15~20 min，EP 管分装封口，将肉汤放置于 4℃ 保存。小鼠腹腔注射 1mL 6% 淀粉肉汤（注意避开肠管和内脏），刺激 60~72h。颈椎脱臼法处死小鼠，用 75% 酒精浸泡小鼠 5min。将小鼠置于解剖板中，固定四肢，剪开皮肤，充分暴露腹膜。用眼科镊子提起腹膜，用 5mL 注射器往小鼠腹腔注射 2.5mL 预冷 PBS（勿扎到脏器），轻揉小鼠腹部1~2 min。注射器回抽腹腔灌洗液，收集于15mL 离心管中。重复第 5 步 5 次，冲洗腹腔，可观察到冲洗液逐渐澄清。将收集的腹腔灌洗液 300 g 离心 5 min，弃上清。用细胞染色缓冲液或者含 10% 胎牛血清的 1640 培养液重悬细胞。进行细胞计数，并调整细胞浓度至 1×107/mL。注意事项：若第 7 步离心弃上清后发现细胞沉淀中有较多红细胞，且检测目的细胞非红细胞，先加入适量红细胞裂解液裂解红细胞（

小鼠淋巴结单细胞悬液制备流程将小鼠颈椎脱臼处死，75% 酒精浸泡 5min，取出小鼠，腹部朝上置于无菌操作台上。用剪子从胸骨起沿正中线一直到颌下将皮肤剪开，再从颌下向左右耳根的方向切开皮肤。用镊子夹着皮肤向左右掀开并用针固定，即可见到胸骨上方的一对体积较大的颌下腺。在左右颌下腺各自的上缘，附着有黄色的颈前部淋巴结。剪断胸锁乳突肌和肌腹，并掀起它们两个断端，可见到左颌下腺背侧深部左、右各有一个小的颈深部淋巴结。用镊子和眼科小剪仔细将淋巴结摘除。取出淋巴结，并浸泡于干净的 PBS 溶液中。用无菌的 2.5mL注射器吸取培养液，左手用镊子夹持淋巴结，右手持注射器，小心插入淋巴结中吹打，至淋巴结细胞完全被吹打干净，观察只剩余白色的结缔组织和脂肪组织为止。将吹打出来的胸腺细胞用 200 目筛网过滤，收集于 15mL 离心管，300g 离心 5min，弃上清。用细胞染色缓冲液重悬胸腺细胞，计数，并调整细胞浓度至 1×107/mL。注意事项：颈部淋巴结颈浅部淋巴结位于左右颌下腺之浅表和外侧，常为脂肪组织所包绕，呈卵圆形。颈深部淋巴结位于左右胸乳突肌和锁乳突肌腹侧的深处，舌骨下方肌肉群的外侧，即颌下腹

小鼠外周血单细胞悬液制备采集小鼠外周血样本于抗凝管中。离心管内加入 100 μL 新鲜血，加入 1 Test 对应流式抗体，混匀，4℃ 避光孵育 30 min。加入 2 mL 1×红细胞裂解液，混匀，4℃ 裂解 5 min。300 g 离心 5 min（裂解完立即离心，防止时间过长损伤细胞），弃上清可得到白色的细胞沉淀。PBS 洗涤一遍。加入 200 μL 细胞染色缓冲液重悬细胞，用流式细胞仪进行检测和分析。注意事项：采血用抗凝管，有肝素和 EDTA 两种，若直接裂解红细胞后进行后续染色实验，两种抗凝管都可使用；如果是采血后进行 PBMC 细胞分离，则必须使用肝素抗凝。裂解液推荐使用 E-CK-A105 10× ACK Lysis Buffer，不含固定剂。10× ACK Lysis Buffer 实验前需用纯水稀释成 1×，现配现用，推荐 4℃ 条件下暂存，当天使用。检测小鼠外周血中常规指标，可用过夜保存的样本，一般来说问题不大，但是对于表达量比较低的指标，建议用新鲜的样本检测。小鼠外周血中细胞量比较低，建议用先染色后裂解的方法。这种方法可以减少样本处理过程中洗涤的次数，从而降低细胞

小鼠肿瘤样本制备颈椎脱臼法将荷瘤小鼠处死，75% 酒精浸泡 5 min，取出小鼠置于无菌操作台上。左手持镊子，右手持弯剪，沿肿瘤边缘剪下长约 1cm 的口子，可清晰看见肿瘤附着于皮下，沿肿瘤边缘轻轻剪开连接处，剥离肿瘤。将剥离的肿瘤放入100 mm 的培养皿中，并在室温下加入 5~10 mL 的 1640 基础培养基。 单细胞悬液的制备A.混合酶消化法待所有肿瘤剥离完毕后，将肿瘤转移至 1.5 mL EP 管中，手持弯剪将肿瘤充分剪碎，边剪边加入1640基础培养基，静置数秒，使用 1 mL 移液器吸出上层较小颗粒，继续剪碎组织，重复加入1640基础培养基，直至所有的组织大小均符合要求。将肿瘤组织悬液转移至 50 mL 离心管中，加入 1640 基础培养基，250 g离心5 min，弃上清，加入4.5 mL 的 1640 基础培养基，重悬细胞沉淀并转移至培养皿中。加入 500 μL 的 10×Triple Enzyme stock solution 混合酶溶液，轻轻吹打至充分混匀，转移至37℃水浴摇床消化孵育 1~2 h。消化结束后用 1640 基础培养基或者 PBS 稀释，再用 200

一、样本准备收集细胞，200 目筛网过滤，收集滤液，300g 离心 5 min，弃上清。向细胞中加入适量细胞染色 buffer(或含1%BSA的PBS)，用移液枪轻轻吹打细胞重悬。 二、细胞计数 用血球计数板或其他仪器对悬液进行计数后，调整细胞浓度约为 1 × 107/mL。 三、设置实验分组 根据实验设计，设置实验分组，每管加入 100μL 细胞悬液。四、封闭 Fc 受体封闭 Fc 受体能减少染色过程中的非特异性染色。小鼠中，纯化的 CD16/CD32 单抗能和 FcγR Ⅲ/Ⅱ结合，封闭非特异性染色，使阴性细胞的背景荧光降至未标记细胞的水平。加入 0.5-1μg 纯的抗小鼠 CD16/32 单克隆抗体，室温孵育 10min。对于人和大鼠，可直接使用过量的与荧光抗体相同来源和亚型的纯化 Ig 或者与目标种属相同来源血清进行阻断，或者用商业化的 Fc 受体阻断剂。 五、细胞表面抗体孵育根据实验设计，除空白对照外，对应的单染管、全染管加入相应的抗体 5μL，混匀，4℃ 避光孵育 30min。 六、固定破膜按照说明书稀释固定破膜液。每管加入1mL 细胞染色 buffer，300g 离心 5

免疫系统是机体抵御外来入侵、清理自身异化细胞或组织的重要组成部分，关乎生物的健康与生存，一直以来是生物学和医学研究的重点和热点领域。在机体的生理和病理过程时，免疫细胞通过脉管系统和血液循环从淋巴器官抵达全身，对血液中免疫细胞的流式分析是生物学和医学研究中最常用的了解机体免疫状态的检查手段之一。血液中的细胞主要分为红细胞（Erythrocytes/Red Blood Cells）和白细胞（Leukocytes/White Blood Cells）。我们常常所说的免疫细胞指的是血液中的白细胞。机体中几乎所有的免疫应答过程，都是由各种不同的白细胞相互协作完成，因此它们也一直都是各种感染、炎症、自身免疫疾病、移植等模型研究的主要对象。Figure1. 造血干细胞分化树白细胞从起源上分为淋巴细胞和髓系细胞。血液中几乎所有细胞都有相同的来源——造血干细胞（Hematopoietic Stem Cells，HSC）。造血干细胞在骨髓中分化为共同淋巴样祖细胞（Common Lymphoid Progenitors，CLP）和共同髓系祖细胞（Common Myeloid Progenitors，CMP）

CD45 由一类结构相似、分子量较大的跨膜蛋白组成，广泛存在于白细胞表面。CD45 分子在所有白细胞上都有表达，是细胞膜上信号传导的关键分子，在淋巴细胞的发育成熟，功能调节及信号传递中具有重要意义，其分布可作为某些 T 细胞亚群的分类标志。 图一：CD45/SSC-H与FSC-H/SSC-H分群对比 ❖ 如左图所示，通过 CD45 与 SSC-H，可以非常快速地圈出淋巴细胞亚群。❖ 如右图所示，使用 FSC-H 与 SSC-H 确定细胞群分布时，如果不染 CD45，加上有时红细胞裂解效果不佳，淋巴细胞群容易与红细胞及细胞碎片分群不清晰，且易有单核细胞混杂，不利于圈门位置的确定。而通过 CD45/SSC 圈门，可以使圈出的淋巴细胞更纯。 中华人民共和国卫生行业标准文件中的《流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南》也指出：建议联合 CD45 和 SSC 设门，确定淋巴细胞群。淋巴细胞群通常呈现 CD45 强阳性和 SSC 弱表达；相对于淋巴细胞，单核细胞的 CD45 呈弱表达，SSC 呈中等强度表达；嗜碱性粒细胞的 CD45 和 SSC 均为弱表达。同时，CD45 在三色、四色抗体组合方案

昼夜节律紊乱，如熬夜不睡、夜班工作，可能会对健康产生多种不良影响。其中，也与心脏疾病的发生有关，目前尚不清楚心脏分子时钟功能障碍是否与自然发生的人类心脏病进展有关。核受体 Rev-erbα/β 是生物钟的关键组成部分，已成为心脏病的药物靶点，但心脏 Rev-erb 的功能在体内尚未得到研究。 2022 年 1 月 17 日，美国德克萨斯州贝勒医学院孙正，中国医学科学院宋江平，和中国温州医科大学附属第二医院等多家单位合作，在 Circulation 上发表了题为 Myocardial Rev-erb-Mediated Diurnal Metabolic Rhythm and Obesity Paradox 的研究性论文，发现心肌细胞中的 Rev-erbα/β 介导正常的代谢节律，使心肌细胞在小鼠休息时间（白天）更喜欢脂质作为能量来源，去除 Rev-erbα/β 会破坏这种节律，降低心肌细胞在休息时间使用脂质的能力，并导致进行性扩张型心肌病和致命的心力衰竭。图片来源：Circulation研究内容 Rev-CKO 小鼠出现进行性收缩功能障碍和致死性心力衰竭 Rev-erbα 和 Rev-e

导读 镁，作为哺乳动物细胞内最重要的微量营养素之一，参与数百种的化学反应和生物学过程，例如，协助肌肉收缩，调控心脏正常的节律等。最新的研究还表明，镁在免疫系统发挥功能的过程中扮演着重要的角色，但其具体的分子机制尚未明确。 此外，低镁饮食或低镁血症与各种疾病的病理生理学相关，包括感染和癌症。当小鼠接受低镁饮食时，癌细胞在小鼠体内的扩散速度更快，而且它们对流感病毒的防御能力也受损。然而，到目前为止，关于这种矿物质究竟如何影响免疫系统的研究还很少。 2022 年 1 月 20 日，来自瑞士巴塞尔大学等单位的研究团队在 Cell 发表了题为 Magnesium sensing via LFA-1 regulates CD8+ T cell-effector function 的研究性文章，他们发现共刺激细胞表面分子 LFA-1 需要镁来改变其构象，从而促进其活化 CD8+ T 细胞的能力，最终增强 CD8+ T 的细胞毒性。同时，镁的参与也可显著提高病原体和肿瘤特异性 T 细胞的效能，增强了双特异性 T 细胞抗体的效力，并改善了 CAR-T 细胞的功能等。 总的来说，这项研究拓宽了领域内对镁在

经典型瞬时受体电势通道 TRPC 是一类通透钙离子的非选择性阳离子通道1，与最早在果蝇感光系统中发现的 TRP 通道的序列相似性最高2,3，并且可以被第二信使 DAG 所激活。根据序列相似性以及通道的电生理特性，TRPC3/6/7 形成了一个亚类4。TRPC3/6/7 通道参与多种神经活动，例如 TRPC3 在中枢神经系统高表达，参与神经生长因子 BDNF 信号转导5，同时 TRPC3 还与神经突触信号传递以及运动协调有关6,7。TRPC6 通道可以促进神经元存活以及兴奋性突触的形成等8,9。除此之外，TRPC3/6/7 通道也参与肌源性血管收缩，血压调节等过程，并且和多种疾病的发生有关，比如病理性心肌肥大，癌症发生，糖尿病等10。其中人源 TRPC6 基因功能获得性突变（GOF）会引发局灶节段性肾小球硬化症（FSGS）11,12。因此，TRPC6 通道的抑制剂有望用于治疗该类疾病。2007 年有低分辨率冷冻电镜研究表明 TRPC3 的胞质区可能存在一个空腔13，但由于分辨率所限，以及重构所得电子密度存在较多噪音，该空腔的具体结构细节并不清楚。2017 年陈雷课题组和吕伟/杜鹃课题组分

近日，中南大学湘雅二医院麻醉科戴茹萍教授团队在自然指数期刊、Science 子刊Science Advances（IF = 14.1）发表了题为 Upregulation of proBDNF/p75NTR signaling in antibody-secreting cells drives systemic lupus erythematosus 的原创研究，揭示了 proBDNF 在自身免疫性疾病系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus, SLE）中的重要致病以及干预靶点作用。戴茹萍教授课题组一直致力于脑源性神经营养因子前体（Bain-derived neurotrophic factor precursor, proBDNF）的免疫功能研究。以往 proBDNF 被认为在神经系统中发挥作用，课题组前期研究开拓性地发现 proBDNF 介导多种免疫炎症性疾病发生发展，包括脓毒症相关脑病 （Journal of Neuroinflammmation, 2020）、主动脉夹层疾病 (FASEB J, 2020) 和多发性硬化症 (Therano

自然界的蚊媒病毒有数百种之多，可由蚊虫携带并传播给人类及动物宿主，引起病毒性脑炎、脑膜炎及出血热等严重疾病。近二十年来，以登革病毒、寨卡病毒、基孔肯亚病毒、西尼罗病毒为代表的新发及再发蚊媒病毒在全世界流行，每年可导致数十亿人感染、数十万人死亡。 以登革病毒为例，全世界大约有 25 亿人口生活在登革病毒流行地区，每年约有 3.9 亿人被登革病毒感染或重复感染，并导致 50~100 万人入院治疗，全世界范围内已有 100 多个国家及地区出现登革热的感染流行。据报道，登革热 2022 年度再次在巴西、新加坡、马来西亚等国家大规模暴发流行，目前已导致超 65 万人感染入院治疗（截止 2022 年 5 月份）。 由于登革病毒等重要蚊媒病毒的致病机制特殊，其感染或免疫后产生的抗体具有增强感染的作用（抗体依赖增强效应，ADE 效应），使得传统的传染病预防（疫苗）及治疗（药物）策略研发受阻。到目前为止，多数烈性蚊媒病毒均无有效疫苗和针对性治疗药物，科学界亟需深入研究蚊媒病毒在自然界中流行传播的基本原理，并研发新型防控策略阻断病毒在世界范围内的大规模传播。 2022 年 6 月 30 日，清华大学医学院

人体是丰富多样的微生物的寄主，彼此之间形成了复杂的关系网络。数万亿种微生物排列在人类胃肠道中，直接影响宿主的健康。已有研究表明，肠道菌群在肥胖、心血管疾病和糖尿病的病理生理中十分重要。当人体中存在更多类型的肠道菌群时，患这些疾病的风险往往会较低。 发酵食品，如酸奶、白干酪、泡菜和康普茶等，被认为具有增强肠道菌群多样性以及减少炎症标志物的潜力。啤酒也是一种发酵产物，含有多酚等化合物以及发酵过程中的微生物，这些物质可能会影响人类肠道中微生物的种类。 近日，美国化学学会（ACS）旗下期刊 Journal of Agricultural and Food Chemistry 上发表了一篇题为 Impact of Beer and Nonalcoholic Beer Consumption on the Gut Microbiota: A Randomized, Double-Blind, Controlled Trial 的研究论文。该研究结果表明，在持续 4 周的试验期间，每天喝含酒精啤酒或无酒精啤酒的男性，他们的肠道微生物多样性都比试验前更高，肠道健康有所改善，这可能可以降低某些疾病的患病

导读 当今社会，由于电子产品的普及、久坐职业的增加，以及交通方式的改变，「久坐不动」已成为许多人的日常写照。 已有不少研究表明，久坐对身体有着多种危害，增加慢性疾病风险、升高患癌风险和死亡风险等。2020 年，世界卫生组织发布的《关于身体活动和久坐行为指南》（WHO guidelines on physical activity and sedentary behaviour）建议每个人都限制久坐时间，参加高水平的身体活动，以减少久坐的有害影响。 2022 年 6 月 15 日，中国医学科学院 & 北京协和医学院阜外医院联合加拿大西蒙弗雷泽大学等单位的研究人员在 JAMA Cardiology 发表了题为 Association of Sitting Time With Mortality and Cardiovascular Events in High-Income, Middle-Income, and Low-Income Countries 的文章。 通过对来自 21 个国家的 100,000 多人进行了平均 11 年的调查研究发现，与每天静坐时间少于 4 小时的人相

真核生物细胞中，基因编码区（exon）由内含子（intron）隔断，在转录翻译过程中，内含子需要经过 pre-mRNA 剪接来去除。RNA 剪接是真核生物「中心法则」的关键步骤之一，是蛋白质多样性、复杂性的分子基础。RNA 剪接体缺陷是导致人类疾病的重要原因之一，据估计可能超过 60% 的疾病与 Pre-mRNA 剪接有关。[1,2] 西湖大学施一公课题组十多年来聚焦酵母及人源剪接体结构解析及分子机制研究，取得了丰硕的成果。其中包括 10 篇 Science、4 篇 Cell、1 篇 Nature、3 篇 Cell Research 等超过 18 篇研究论文，构建了剪接体研究领域的一个闭环，对于人们认识真核生物剪接体的组成和它与相应内含子的识别机制有着重要意义，对于药物靶点设计应用具有不可估量的作用。图片来源：Molecular Cell 2022 年 6 月 14 日，西湖大学施一公团队在 Molecular Cell 在线发表研究论文 Mechanism of exon ligation by human spliceosome，利用冷冻电镜技术解析了人类剪接体复合物两种中间体

外周血样本采集完毕后，我们需要对其中的待测单细胞进行提取。针对外周血样本，最常使用的样本制备方法有两种： 一. 裂红法利用红细胞裂解液，去除红细胞 二. Ficoll 法利用不同细胞的沉降系数差异，进行梯度密度离心，提取 PBMC 两种方法分别在什么场景下应用？接着往下看。 裂红法裂红法，即裂解样本中的红细胞。血液中的红细胞比白细胞多 10-100 倍，红细胞数量过多，会影响细胞群体的分析。因此，我们在做血液样本检测时，经常需要裂解红细胞。裂红前 裂红后01 原理红细胞表面有专属的表面抗原，当裂解液中含有可以攻击特定红细胞表面抗原的酶，就只会造成红细胞的变形、膨胀、裂解。02 优点⊙ 各类型白细胞（淋巴细胞、单核细胞、粒细胞等）保存完整⊙ 得率高⊙ 步骤简单，10min 即可03 缺点⊙ 对裂红时间要求较高，过长或过短均会影响结果⊙ 细胞活性低于 Ficoll 法04 使用注意事项⊙ 裂解时间过长，也会对其它细胞造成损伤，所以要把握好裂解的时间；⊙ 做流式检测时，并非所有的血液样本都需要裂红。倘若需要检测的是白细胞（如淋巴、单核、粒细胞等），需要裂解红细胞；倘若检测的是红细胞，不需要裂

粘连体，是指两个或更多个细胞粘在一起（大多数是两个）的现象。理想状态下，细胞是一个一个通过流式细胞仪激光照射区的。细胞通过激光照射区所产生的荧光信号被 PMT 接收，转化成电脉冲信号，如图所示：从细胞进入激光照射区到离开，电脉冲信号由 0 到达峰值，再降回 0，被记录为一个峰值。H是脉冲高度，代表脉冲信号的峰值，W 是脉冲宽度，是指细胞通过激光照射区域的时间，A 是脉冲信号的面积。现实情况下，由于各种原因，细胞与细胞会粘在一起，连续通过激光照射区，被仪器认定为一次信号。当两个细胞挤在一起通过仪器，与单个细胞相比，测量高度不变，宽度和面积变为两倍，即出现 FSC-Height 不变，FSC-Area 和 Width 增大的现象，如图所示：分析数据时，如果没有排除粘连体，就可能对结果的判断造成误导。举个例子：如果样本中一部分细胞带有 GFP 绿色荧光，一部分细胞不带荧光，需要分选出带有 GFP 信号的细胞，细胞在缓冲液中的状态，可能会出现以下 5 种情况：单细胞粘连体一个带 GFP 和一个不带 GFP 的细胞形成的粘连体（红框），在没有被排除的情况下，会被默认为是带 GFP 的细胞，从而被

大部分老师做流式实验时，会用到空白对照、单阳对照、同型对照、生物学对照等，用到 FMO 对照的比较少。尽管如此，FMO 对照在设置圈门时仍具有重要的参考价值。 一方面，FMO 对照有助于精确地设置阴阳性群体界限。我们在做多色实验时，可能会出现某些通道信号难以区分的情况，主要是因为其他某个荧光对该通道的干扰很大。FMO 对照（Fluorescence Minus One，荧光扣除一）减少了其中一个通道的荧光抗体，能够帮助衡量其它通道的荧光漏溢情况。如下图所示，PerCP/Cyanine5.5 的单阳管有明显的分群，而全染管无法分群，通过 FMO 对照（扣除 PE 的多色结果），PerCP/Cyanine5.5 的通道信号又出现较明显的分群，证明 PE 对 PerCP/Cyanine5.5 通道的干扰较大（不同仪器的滤光片稍有不同，会导致不同通道的干扰有差异，请依据具体仪器通道做分析）。另一方面，FMO 可以作为某些指标的阴性对照，用来排除全染的背景影响，便于更准确地划门。如图所示：如果以空白管来确定阴性细胞群，通常会以灰色线作为 PE 的阴性细胞群划门，可能会导致实验组结果出现偏差。如果

原理 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是利用抗原和抗体的特异性结合以及 Protein A 或 G 特异性地结合到抗体的Fc 片段的现象探测两个蛋白分子间是否存在相互作用的一种方法。在细胞裂解液中加入针对蛋白M的抗体，孵育后再加入Protein A 或 G 预处理的 Sepharose 珠，若细胞中有与蛋白M结合的蛋白 N，就可以形成这样一种复合物：“蛋白 N-蛋白M—抗蛋白 M 抗体—Protein A 或 G—Sepharose 珠”，经 SDS-PAGE 电泳分析检测结果。这种方法得到的目的蛋白 N是在细胞内与蛋白 M 天然结合的，符合体内实际情况，得到的结果可信度高。这种方法常用于测定两种目标蛋白是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。 步骤 用预冷的 PBS 溶液洗涤贴壁细胞两次（对于悬浮细胞则用台式离心机以 800-1000 rpm 转速通过离心洗涤）。 加入预冷的 RIPA 液（含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂），RIPA 液的用量：按照 0.5 mL 每 5×106 细胞计算。注：悬浮细胞，收集细胞沉淀后，加入预冷