全部

小鼠胸腺单细胞悬液制备流程1.用颈椎脱臼法处死小鼠，75%酒精浸泡5 min后，取出小鼠置于无菌操作台上，腹部朝上。小鼠胸骨下方剪开小鼠的胸腔，可看到白色透明胸腺，呈两叶分布，位于两肺的前方，胸骨的正后方。取出胸腺并浸泡于干净的PBS溶液中。将胸腺置于200目筛网中，用组织研磨棒轻轻研磨至没有明显块状物。用15 mL PBS冲洗筛网，并将冲洗液收集于15 mL离心管，300 g离心5 min，弃上清。用细胞染色缓冲液重悬胸腺细胞，并调整细胞浓度至1×107/mL。注意事项:打开胸腔分离胸腺，注意不要切断大血管及弄破心脏。如有必要，可在处死小鼠前向腹腔注入0.1 mL黑墨水，染黑胸腔各淋巴结，便于识别和摘除。3~6周龄的小鼠，一般可获得2 ×108个细胞。随小鼠年龄增长，胸腺细胞逐渐减少。

流式细胞技术（Flow cytometry, FCM）是利用流式细胞仪进行的一种单细胞定量分析和分选技术。流式细胞术是单克隆抗体及免疫细胞化学技术、激光和电子计算机科学等高度发展及综合利用的高技术产物，它能有效地从单细胞水平区分异质性细胞群体，检测对象包括但不限于悬浮细胞、贴壁细胞或从实体组织分离的单细胞悬液和其他生物颗粒。 一、细胞表面染色步骤样本准备1.1 采集全血或组织（脾，淋巴结，胸腺和骨髓），用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)制成单细胞悬液。对于体外刺激的细胞，直接将刺激后的细胞悬浮在细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)中，然后进行第2步。1.2 加满细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS), 300g离心细胞悬液5分钟，弃掉上清。 红细胞裂解2.1 如需裂解红细胞（如脾脏），将10x红细胞裂解液(ACK buffer)用去离子水稀释到1x，放置到室温。将细胞重悬于3mL的1x ACK buffer中，室温孵育2-3分钟；如不需要裂解红细胞，直接进入第3步,。2.2 加入10mL细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)终止红细胞裂解，30

多色流式实验中，由于不同荧光素的发射波长的覆盖范围不同，可能产生重叠，对实验结果的数据分析造成一定干扰，我们通常会设置单阳管进行调节补偿。同时，单阳管还可以辅助我们调节通道电压，防止信号超出接收范围。图示：常见荧光素的发射光谱A. 如何设置单阳管单阳管即单染管，是只添加一种荧光抗体的样本管。一般来说，实验 panel 有几种荧光，就需要设置几个单阳管。如：APC、PE、FITC 的三色 panel，需要设置三个单阳管。B. 制备单阳管的要求①单阳管和全染管的样本类型、荧光素要保持一致；②单阳管和全染管的样本处理要相同，如：全染管进行了固定破膜处理，单阳管即使是表面因子，也需要进行固定破膜；③单阳管上机的电压要和全染管保持一致；④单阳管要保证有足够的阳性细胞群。C. 单阳对照常见问题问：目标 marker 表达量高，阴阳细胞分群明显，也需要设置单阳管吗？答：如果 panel 的指标少，可以不用设单阳管，通过手动调节补偿，将细胞调整到横平竖直的状态即可。但是，如果 panel 的指标比较多，就必须都设置单阳管。补偿前 ↓补偿后 ↓图示：FITC 和 PE 之间存在荧光补偿，但 CD4 和

随着生物研究进入基因时代，转染技术的应用越来越广泛。在此过程中，通常会引入 GFP（绿色荧光蛋白）标签，去验证转染是否成功。在之前的流式课堂中，我们曾多次提到过流式配色问题。今天，就来带大家看看，带有 GFP 标签的细胞，在流式凋亡检测中，应该如何配色和分析结果。 一、如何选择试剂盒挑选试剂盒时，需要选择干扰少的荧光组合。GFP 的激发/发射波长为 488/510，通常在流式细胞仪中的检测通道为 FL1。因此，我们不能选择荧光标签为FL1检测通道的凋亡检测试剂盒，如 AF488、FITC、EGFP 等。在这里，比较推荐的荧光组合是 Annexin-V APC/7AAD。APC 的激发/发射波长为 650/660，7AAD 的激发/发射波长为546/650，可以很好地降低 GFP 带来的干扰，使结果分析更加准确。二、如何分析结果在选择了合适的试剂盒进行上机检测后，恰当的结果分析，对于数据的完美呈现，也是至关重要的。以前文数据为例，我们来看看如何分析： 01 设置 FSC/SSC 圈门根据大小及颗粒度，圈出需要分析的细胞群体，排除碎片及黏连体的影响；02 调整荧光补偿通过荧光波谱图，可以看

做过流式实验的同学，对 CD4、CD8 这两个指标都不会陌生。检测 CD4+ T 细胞和 CD8+ T 细胞分型，是流式中最常见的实验之一。 通常，我们会先检测 CD3，来圈总T淋巴细胞，再分别用 CD4 抗体和 CD8 抗体，来区分 CD4+ T 淋巴细胞（辅助或调节性T细胞）和 CD8+ T 淋巴细胞（细胞毒性 T 细胞）。新生小鼠脾脏细胞 上图为新生小鼠脾脏细胞进行的 CD3-PE、CD4-FITC、CD8-APC 三色流式实验结果。从图中可以看出，在新生小鼠脾脏中，绝大部分细胞是不共表达的单阳细胞，其中约 2/3 为 CD4+CD8- 细胞，1/3 为 CD4-CD8+ 细胞。 在成熟的 T 淋巴细胞中，CD4 和 CD8 是互斥的两个指标，因此，在前期配色、后期调节补偿和数据分析的时候，都不太容易出错。通常情况下，二者不共表达，然而有一类 CD4、CD8 共表达的细胞，却常常被流式新手忽略——胸腺淋巴细胞。胸腺是 T 细胞分化、发育、成熟的场所。胸腺细胞是处于不同分化阶段的 T 细胞。在骨髓中分化出的淋巴细胞样祖细胞，经过血液循环进入到胸腺，在胸腺中完成 T 细胞的发育，成

外周血是我们流式实验中常用到的样本之一。由于血液离体后会在凝血因子的作用下凝固（图1），采集外周血样本时，需要使用带抗凝剂的采血管，或采集后立即加入抗凝剂。通常，我们流式实验中用到的抗凝剂有两种：EDTA 和肝素。图1：凝血（左）与抗凝（右）效果展示 1 两种抗凝剂的抗凝原理EDTA（乙二胺四乙酸）：EDTA 能与血液中的 Ca2＋ 螯合，使 Ca2＋ 失去凝血作用，阻止血液凝固。常用的是钠盐或钾盐。 肝素：加强抗凝血酶（AT）灭活丝氨酸蛋白酶的作用，阻止凝血酶的形成和血小板的聚集，从而阻止血液凝固。 2 两种抗凝剂的特点 EDTA钾盐在血液中的溶解性更好，因而使用较多，尤其是二钾盐——EDTA-K2 可以通过喷雾干燥法附着在采血管的内表面，不会对采集的血液样品产生稀释。EDTA 对血细胞形态的影响比较小，有较好的稳定性，但 EDTA 会抑制或干扰纤维蛋白凝块形成时纤维蛋白单体的聚合，不适于血凝和血小板功能的检测，也不适用于钙、钾、钠及含氮物质的测定。 肝素肝素螯合力低，对水分子运动的影响小，对血液成分的干扰少，不影响红细胞体积，不引起溶血，可谓优点众多。但肝素也有两个明显缺点： ●

细胞周期（cell cycle）是指连续分裂细胞从一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂结束所经历的整个过程。细胞周期的研究对于深入了解生物的生长发育和控制肿瘤生长等有重要意义。如：在癌症治疗中，G0 期细胞对化疗不敏感，癌细胞难以被有效杀灭，往往成为日后癌症复发的根源。通过诱导 G0 期癌细胞进入细胞周期，提高化疗敏感性，可以有效杀伤癌细胞。 细胞周期的检测，主要是利用细胞内 DNA 能够和某些特定荧光染料（如碘化丙啶，PI）结合的特性。由于细胞各个时期的DNA 含量不同，其结合的荧光染料的量也不同，通过流式细胞仪检测荧光强度，即可反映细胞周期变化情况。 此检测方法操作简便，仅需简单的固定染色即可进行检测，但很多同学做出来的结果还是不够理想。本文将带大家来看看细胞周期检测中常见的问题及解决方案：细胞周期检测中，CV 是指 G0/G1 期峰变异系数(Coefficient of Variance，CV)，是评价周期结果好坏的一个重要指标，其值越小越好。CV 值过大的异常原因及相应解决方案如下：进行周期检测时，发现 G2/M 期缺失，首先要确定我们所检测的细胞是能够进行分裂增殖的，如：外周血

导读据最新研究数据表明，人类肢体缺失的发生率预计将在未来 30 年里大幅增加，每年约可影响 360 万人，如糖尿病患者、退伍军人、创伤幸存者和周围动脉疾病患者等。尽管发育和再生医学领域已经取得了非常大的进展，但让整个复杂器官成功再生这一目标仍然难以实现。目前，临床医生仍然缺乏有效的手段来促进组织的恢复或逆转组织损失。包括蝾螈、海星、螃蟹和蜥蜴在内的许多生物至少有部分肢体可以完全再生，扁虫甚至可以被切成碎片，每一块都可以重建为一个完整的有机体。人类的肝脏在损失 50% 后，具有惊人的、几乎像扁虫一样的再生能力，几乎可以恢复到原来的大小，但通过自然再生来恢复动物肢体功能的可能性仍然遥不可及。 2022 年 1 月 26 日，来自美国塔夫茨大学等单位的科学家们在 Science Advances 发表了题为 Acute multidrug delivery via a wearable bioreactor facilitates long-term limb regeneration and functional recovery in adult Xenopus laevis 的文章，他

急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia, AML）是最常见的致死性造血系统恶性肿瘤之一，也是成人最常见的急性白血病，具有复杂的基因多样性。AML 的发生率随年龄增长而增长，老年患者预后尤其差。AML 的可选治疗方案十分有限。过去几十年，一线治疗方案主要是非特异性的标准化疗。多种 AML 亚型, 如 MLL 重排的 AML 或 TET2 基因突变的 AML，即使给予化疗，仍常显预后不佳[1]。近些年人们逐渐认识到，单独讨论基因（遗传学）异常，如基因突变、染色体重构、基因拷贝数异常等，已无法完全解释 AML 复杂的病理表现和预后；而表观遗传学调控则是在遗传学基础上的进一步精细调整。蒋晞研究团队近年的研究发现，这类微调往往能在白血病的发生发展、药物反应等方面起到决定性作用[2-6]。因此，进一步研究表观遗传学调控在白血病中的作用机制，以及开发干预表观遗传调控的治疗白血病的新途径具有重要意义。TET (Ten-eleven translocation) 家族蛋白 TET1/2/3 可介导 DNA 发生 5-羟甲基胞嘧啶 (5-hydroxymethylcytosine,

导读 随着生活水平的提高，肥胖在人群中已越来越普遍，已成为威胁人类健康的全球性公共卫生问题。肥胖，是一种能量平衡失调的状态，与多种疾病的发生发展有关，包括代谢综合征、心血管疾病、糖尿病、非酒精性脂肪性肝等。科研领域内对能量稳态的决定因素进行了数十年的研究，但超重、肥胖及其并发症的发生率仍在全球范围内持续上升。 有研究发现，当身体处于禁食状态时，负责分解精氨酸的基因异常活跃；也有课题组发现精氨酸酶 2（ARG2），作为肝细胞葡萄糖戒断诱导因子，能够发挥部分热量限制的治疗性作用。此外，精氨酸酶 1 和精氨酸酶 2 的多态性决定了添加或未添加精氨酸的饮食环境下身体的精氨酸水平。总之，这些数据提示，增加精氨酸分解代谢可以调节宿主的精氨酸状态，从而在治疗上指导能量代谢。 2022 年 1 月 18 日，来自华盛顿大学医学院等单位的研究人员在 Cell Reports Medicine 期刊发表了题为 Pegylated arginine deiminase drives arginine turnover and systemic autophagy to dictate energy meta

熬夜一时爽，一直熬夜火葬场！研究表明，熬夜会严重影响身体健康，科研小伙伴们得注意平衡昼夜节律啊！ 本周学术君继续带来 CNS 最新科研进展，助力大家勇攀学术高峰！ 1. Neuron：早期爱的抱抱促进愉悦社交的神经环路机制 肢体触摸比语言或其他情感交流的效果强数倍。 2022 年 1 月 18 日，北京大学于翔教授团队在 Neuron 杂志上发表研究论文 Social touch-like tactile stimulation activates a tachykinin1-oxytocin pathway to promote social interactions。 该研究建立了对幼年小鼠进行肢体抚摸的行为范式，发现早期抚摸对于小鼠成年后的社交活动具有积极意义，揭示了早期抚摸促进愉悦社交的神经环路机制！图 1：来源 Neuron 2. Nature Genetics：感染新冠后嗅觉味觉丧失的原因 感染新冠的病人嗅觉和味觉会不同程度地受到损伤。 2022 年 1 月 17 日，美国 23andMe 公司 Adam Auton 研究员团队在 Nature Genetics 杂志发表研

每月一次的生理期（月经）是女性身体健康状况的反映，不管是青春期、孕前后还是绝经后女性，想必都曾受到过月经出血量过多或过少的困扰。 众所周知，许多外界因素会影响月经周期的长度和月经出血量，包括饮食、睡眠和运动，以及疾病、旅行和压力。不少女生为了每月能够拥有舒适的生理期，不影响正常的工作和学习节奏，在养生方面可谓是煞费苦心。 然而，总会有些许不可控的因素影响着女性的生理周期。最新一项大规模研究调查显示，接种新冠疫苗会影响女性月经期出血量，42% 的女性参与者表示接种后经期出血量比平时更多！ 2022 年 7 月 15 日，美国伊利诺大学厄巴纳－香槟分校 Kathryn Clancy 教授和圣路易斯华盛顿大学医学院 Katharine Lee 教授在 Science Advances 杂志发表研究论文 Investigating trends in those who experience menstrual bleeding changes after SARS-CoV-2 vaccination。该研究以数量超过 3.5 万、接种了新冠疫苗的女性作为调查对象，证实了新冠疫苗对于女性生理期

2019 年, 著名医学杂志 Lancet 发表 2017 年全球疾病研究系列报告，指出全球不良饮食相关的死亡中，有三大因素分别为高盐饮食，全谷类摄入不足和水果摄入不足。 近几十年来，中国的心血管疾病发生率迅速上升，由心血管病导致的死亡已占我国总死亡的 45%。在我国因不良饮食而导致的心血管疾病死亡率高居世界前列。 面对不健康饮食对人类健康的危害，欧美国家先后开发了多种健康膳食模式。其中，美国的 DASH 饮食和欧洲的地中海饮食最为流行，并已被研究证明能够降低血压、改善血脂，有利于心血管健康。然而，这些来自西方饮食文化的膳食模式并不符合中国人的饮食习惯，因此难以在中国人群体中推广开来。 为了让中国人能吃上符合自己口味的健康膳食，北京大学临床研究所武阳丰教授提出了要开发符合中国人口味的健康膳食，并以符合中餐文化且 「好吃、不贵、又健康」作为「中国健康膳食」的开发目标。 2022 年 7 月 11 日，北京大学临床研究所武阳丰教授与王燕芳研究员共同领导的最新研究发表于美国心脏协会旗舰期刊《循环》（Circulation, IF = 39.918）。该研究中开发了「中国心脏健康膳食」并对其降

上世纪 60 年代，医生在检查人体白细胞中的染色体数目时，出乎预料地发现男性的一些白细胞会丢失部分 Y 染色体，并且随着年龄增长，Y 染色体丢失的频率越高。 男性白细胞中 Y 染色体的丢失，可能与疾病和死亡率有关，但之前尚未确定明确其中的因果关系。 2022 年 7 月 14 日，乌普萨拉大学的研究人员在 Science 杂志上发表了一项国际研究论文。研究中表明，男性白细胞中 Y 染色体的丢失会导致心脏纤维化，心脏功能受损以及心血管疾病引起的死亡。图片来源：Science之前的研究调查表明，男性的平均寿命比女性短五年左右。该研究的通讯作者 Kenneth Walsh 表示，该研究中揭示的男性 Y 染色体的丢失所造成的健康影响或许可以解释男女寿命的差异。男性体内部分细胞中的 Y 染色体丢失被称为 mLOY（mosaic loss of chromosome Y, Y 染色体镶嵌丢失），这是一个很常见的现象，在至少 20% 的 60 岁男性和 40% 的 70 岁男性中被检测到。此前的研究表明，血液中含有 mLOY 的男性患与年龄相关的疾病（如癌症和阿尔茨海默病）的风险增加。本研究中证实，

众所周知，男性和女性之间存在明显的差异，无论是从生理和思维，还是从健康和行为，两性之间都有着天壤之别。更加令人惊奇的是，男性和女性在晒太阳的反应上竟然也有区别。 2022 年 7 月 11 日，由以色列特拉维夫大学萨克勒医学院人类遗传学和生物化学系的 Carmit Levy 领衔的团队在 Nature Metabolism 上发表了题为 Food-seeking behavior is triggered by skin ultraviolet exposure in males 的研究性论文，发现紫外线（UV）辐射对男性和女性产生不同的影响，阳光暴露刺激了男性而不是女性的觅食行为，其机制是依赖于皮肤脂肪细胞的饥饿素（Ghrelin，一种刺激食物摄入的激素）的分泌。图片来源：参考资料 [1]研究背景 晒太阳这事儿，可以说是一把双刃剑。过度晒太阳，可能会灼伤皮肤，严重甚至会造成皮肤癌。相反，适当晒晒太阳，可以补充维生素 D，增加肝脏代谢，保护器官免受肝细胞脂毒性和代谢疾病，而且可以防止心血管疾病和其他死亡原因。然而，男性和女性对 UV 辐射等环境因素的反应是否不同仍有待研究。 研究内容

1.无染色/弱染色2.高背景/非特异性染色3.染色异常情况

#01 什么是同型对照？同型对照（Isotype Control），是指与使用的流式抗体具有相同种属来源、亚型、荧光标记物、使用剂量和浓度，但对目标靶点无特异性结合的抗体。同型对照通常用来消除抗体与抗原的非特异性结合造成的背景染色。 #02 为什么要做同型对照？流式抗体与靶标的结合，是通过抗体的 Fab 端与靶标 Marker 进行特异性结合而完成的。白细胞（除T细胞外）表面大多表达 CD16、CD32、CD64 等 Fc 受体，这些受体可与各种抗体的 Fc 端非特异性结合，出现非特异性染色。其中，以单核细胞、巨噬细胞尤甚。此外，除 Fc 受体的影响外，在活细胞的表面染色实验中，单核细胞和巨噬细胞均存在吞噬抗体或与荧光染料发生非特异性结合的现象。并且，在多色流式实验中，还存在荧光背景的影响及药物处理的影响，即便对 Fc 受体进行了封闭，在分群不好的情况下，依然需要用到同型对照。此时，同型对照的使用也就十分重要。实验时，如果仅仅参照空白对照来圈门，就可能出现一部分假阳性结果。如果参考同型对照来区分阴阳性，就能够把这部分非特异性结合造成的假阳性排除。 FcR分子 目标蛋白分子 以 CD45

人外周血PBMC的制备流程收集抗凝人外周血，用 1640 无血清培养基或 PBS 按照 1:1 的比例稀释，上下颠倒混匀或者用移液枪吹打混匀。在 15 mL 离心管中，先加入 3 mL 充分混匀的 Ficoll 液（1.077 g/mL），再沿着管壁缓慢加入2 mL稀释后的血液，血液和 Ficoll 液分层明显为成功。注：Ficoll 提前半小时从 4℃ 冰箱取出恢复到室温，温度过高会导致分离不明显，温度过低会导致密度过大，同样分离效果不好， 20~25℃ 最佳。。将样本小心转移到离心机，500 g 离心 25 min。小心取出离心管，吸取中间层的白色薄膜层，即为单个核细胞。用 10 mL PBS 洗涤获得的单个核细胞，250g 离心 10 min，弃上清。重复洗涤一次。用细胞染色缓冲液重悬细胞备用。注意事项：Ficoll 使用时的温度很重要，温度太高或者太低都会影响分离效果。血液样本最好为新鲜抗凝血（采血 2 h 以内），为保持细胞活力，应避免冷冻和冷藏。3.50 mL 离心管离心效率比 15 mL 离心管差，为了获得最大量的单核细胞，最好用15 mL离心管，且离心管使用量不要超过三

小鼠腹水及单细胞悬液制备流程配制 6% 淀粉肉汤。6% 淀粉肉汤配制方法：牛肉膏 0.3g、蛋白胨 1.0g、氯化钠 0.5g、蒸馏水 100mL，上述材料混合加热后加入可溶性淀粉 6.0g；溶解后，121℃ 高压灭菌 15~20 min，EP 管分装封口，将肉汤放置于 4℃ 保存。小鼠腹腔注射 1mL 6% 淀粉肉汤（注意避开肠管和内脏），刺激 60~72h。颈椎脱臼法处死小鼠，用 75% 酒精浸泡小鼠 5min。将小鼠置于解剖板中，固定四肢，剪开皮肤，充分暴露腹膜。用眼科镊子提起腹膜，用 5mL 注射器往小鼠腹腔注射 2.5mL 预冷 PBS（勿扎到脏器），轻揉小鼠腹部1~2 min。注射器回抽腹腔灌洗液，收集于15mL 离心管中。重复第 5 步 5 次，冲洗腹腔，可观察到冲洗液逐渐澄清。将收集的腹腔灌洗液 300 g 离心 5 min，弃上清。用细胞染色缓冲液或者含 10% 胎牛血清的 1640 培养液重悬细胞。进行细胞计数，并调整细胞浓度至 1×107/mL。注意事项：若第 7 步离心弃上清后发现细胞沉淀中有较多红细胞，且检测目的细胞非红细胞，先加入适量红细胞裂解液裂解红细胞（

小鼠淋巴结单细胞悬液制备流程将小鼠颈椎脱臼处死，75% 酒精浸泡 5min，取出小鼠，腹部朝上置于无菌操作台上。用剪子从胸骨起沿正中线一直到颌下将皮肤剪开，再从颌下向左右耳根的方向切开皮肤。用镊子夹着皮肤向左右掀开并用针固定，即可见到胸骨上方的一对体积较大的颌下腺。在左右颌下腺各自的上缘，附着有黄色的颈前部淋巴结。剪断胸锁乳突肌和肌腹，并掀起它们两个断端，可见到左颌下腺背侧深部左、右各有一个小的颈深部淋巴结。用镊子和眼科小剪仔细将淋巴结摘除。取出淋巴结，并浸泡于干净的 PBS 溶液中。用无菌的 2.5mL注射器吸取培养液，左手用镊子夹持淋巴结，右手持注射器，小心插入淋巴结中吹打，至淋巴结细胞完全被吹打干净，观察只剩余白色的结缔组织和脂肪组织为止。将吹打出来的胸腺细胞用 200 目筛网过滤，收集于 15mL 离心管，300g 离心 5min，弃上清。用细胞染色缓冲液重悬胸腺细胞，计数，并调整细胞浓度至 1×107/mL。注意事项：颈部淋巴结颈浅部淋巴结位于左右颌下腺之浅表和外侧，常为脂肪组织所包绕，呈卵圆形。颈深部淋巴结位于左右胸乳突肌和锁乳突肌腹侧的深处，舌骨下方肌肉群的外侧，即颌下腹