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流式课堂 | 流式实验对照设置之 FMO

大部分老师做流式实验时,会用到空白对照、单阳对照、同型对照、生物学对照等,用到 FMO 对照的比较少。尽管如此,FMO 对照在设置圈门时仍具有重要的参考价值。 一方面,FMO 对照有助于精确地设置阴阳性群体界限。我们在做多色实验时,可能会出现某些通道信号难以区分的情况,主要是因为其他某个荧光对该通道的干扰很大。FMO 对照(Fluorescence Minus One,荧光扣除一)减少了其中一个通道的荧光抗体,能够帮助衡量其它通道的荧光漏溢情况。如下图所示,PerCP/Cyanine5.5 的单阳管有明显的分群,而全染管无法分群,通过 FMO 对照(扣除 PE 的多色结果),PerCP/Cyanine5.5 的通道信号又出现较明显的分群,证明 PE 对 PerCP/Cyanine5.5 通道的干扰较大(不同仪器的滤光片稍有不同,会导致不同通道的干扰有差异,请依据具体仪器通道做分析)。另一方面,FMO 可以作为某些指标的阴性对照,用来排除全染的背景影响,便于更准确地划门。如图所示:如果以空白管来确定阴性细胞群,通常会以灰色线作为 PE 的阴性细胞群划门,可能会导致实验组结果出现偏差。如果

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免疫共沉淀实验指南

原理 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是利用抗原和抗体的特异性结合以及 Protein A 或 G 特异性地结合到抗体的Fc 片段的现象探测两个蛋白分子间是否存在相互作用的一种方法。在细胞裂解液中加入针对蛋白M的抗体,孵育后再加入Protein A 或 G 预处理的 Sepharose 珠,若细胞中有与蛋白M结合的蛋白 N,就可以形成这样一种复合物:“蛋白 N-蛋白M—抗蛋白 M 抗体—Protein A 或 G—Sepharose 珠”,经 SDS-PAGE 电泳分析检测结果。这种方法得到的目的蛋白 N是在细胞内与蛋白 M 天然结合的,符合体内实际情况,得到的结果可信度高。这种方法常用于测定两种目标蛋白是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。 步骤 用预冷的 PBS 溶液洗涤贴壁细胞两次(对于悬浮细胞则用台式离心机以 800-1000 rpm 转速通过离心洗涤)。 加入预冷的 RIPA 液(含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂),RIPA 液的用量:按照 0.5 mL 每 5×106 细胞计算。注:悬浮细胞,收集细胞沉淀后,加入预冷

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Neuron:北京大学于翔课题组揭示早期抚摸促进愉悦社交的神经环路机制

著名人类学家 Ashley Montagu 认为:「触摸比语言或其它情感交流更强数倍,它几乎影响了我们所做的一切。没有其它感觉能像触摸那样唤起你。我们常常忘记触觉不仅是人类的基本特征,也是人类生存的关键。」 触觉发育先于视觉、听觉、嗅觉等其它感觉,是个体认知世界的最初感官,为运动能力、语言和认知功能的发展打下基础。触觉包含两个维度,即感觉(discriminative touch)和感受(affective touch),前者用来区分各种外界事物,后者用来感受社交互动中的各种情感信息,包括愉悦与厌恶。触觉感觉与感受由皮肤上不同的受体所介导,但触觉感受传入大脑的神经环路尚不清楚。 2022 年 1 月 18 日北京大学于翔课题组在 Neuron 期刊发表了题为 Social touch-like tactile stimulation activates a tachykinin1-oxytocin pathway to promote social interactions 的研究论文,揭示了早期抚摸促进愉悦社交的神经环路机制。中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心于航博士为第一作者。

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基因突变不是随机的?Nature 研究剑指达尔文进化论,挑战经典还是言过其实?

导读 当 DNA 受损且未得到修复时,就会发生突变,从而产生新的变异。科学界一直认为,基因突变是随机发生的事件,这也是许多生物学和进化理论所依据的基础之一,这一命题对现代生物学发展也产生了深远的影响,并塑造了生物学家在过去一个世纪中思考和研究遗传多样性的方式。 然而,基因组生物学的新发现激发了人们对经典理论的重新思考。根据目前最新的研究结果,科学家们发现核苷酸组成、表观基因组特征和 DNA 修复中的偏倚会影响基因组中不同位置发生突变的可能性;与此同时,特定的基因区域和基因类别,如组成性基因表达和必需的管家基因等,能够以不同的表观基因组状态存在,这也为突变偏倚提供了机会;此外,研究人员也发现了 DNA 修复具有针对特定基因区域和特定基因的证据。 2022 年 1 月 12 日,美国加州大学和德国马克斯普朗克发育生物学研究所的研究团队在国际顶尖期刊 Nature 发表了题为 Mutation bias reflects natural selection in Arabidopsis thaliana 的文章,他们通过对拟南芥的 DNA 进行测序,并对基因突变偏倚的原因、后果和适应价值进行

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Cell Death Differ:中大五院黄曦团队发现新冠病毒引起肺损伤的分子机制

近期,中山大学附属第五医院黄曦团队报道了 SARS-CoV-2 的 membrane (M) 蛋白通过靶向并抑制胞内 BOK 的泛素化降解,激活肺上皮细胞线粒体凋亡途径而引起肺损伤,该发现为 COVID-19 的靶向治疗提供了潜在靶点。图片来源:Cell death & differentiation SARS-CoV-2 感染已经导致全球数以百万人的死亡,其中大部分死亡患者出现呼吸困难,肺部出现大量凋亡的细胞和渗漏的粘液,已有研究证实 SARS-CoV-2 感染引起肺细胞凋亡参与上述病理发生。然而,SARS-CoV-2 感染引起肺细胞凋亡的机制仍不清楚。 2022 年 1 月 13 日,中山大学附属第五医院黄曦课题组在 Cell death & differentiation 上发表了题为 SARS-CoV-2 membrane protein causes the mitochondrial apoptosis and pulmonary edema via targeting BOK 研究性论文。该研究证实了病毒膜(M)蛋白会通过靶向 BOK 分子,介导肺上皮细胞

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躺平减肥要成真了!Nature:运动会产生一种关键分子,直接补充就能降低食欲、促进减肥

生命在于运动。常言道,身体锻炼好,八十不服老。保持运动不仅能维持身体的匀称度,而且能够促进机体代谢,使人精神焕发、强身健康,减少罹患疾病的风险。 运动已被证明可以预防肥胖和与肥胖相关的疾病,其增加的能量需求需要机体燃烧更多的卡路里。然而,关于运动对生理机能和代谢健康的长期益处仍然知之甚少。 2022 年 6 月 15 日,美国贝勒医学院徐勇团队联合斯坦福大学医学院病理学系 Jonathan Z. Long 团队在 Nature 杂志发表研究论文 An exercise-inducible metabolite that suppresses feeding and obesity。 该论文发现运动中产生的一种代谢物能够有效地减少实验小鼠的食物摄入量,抵御肥胖。这种作用显著的血浆代谢物被称作 Lac-Phe,其由机体剧烈运动后产生的乳酸和苯丙氨酸组成,使用 Lac-Phe 连续实验处理肥胖小鼠 10 天,可使其食物摄入量大大减少、体重减轻,葡萄糖耐受改善。这项研究有利于阐释运动对于生理和代谢健康的长期益处。图 1:来源 Nature 血浆代谢物 Lac-Phe 初出茅庐 以往大量的研究表

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施一公团队突破性进展再登 Science!以超高分辨率解析核孔复合物的结构细节

非洲爪蟾(Xenopus laevis)作为一种经典的脊椎动物模型,其胚胎发育过程与人类器官形成过程相似,被广泛地应用于 DNA 损伤应答、细胞凋亡、免疫和炎症反应以及再生和可塑性的研究。 真核生物的细胞核由双层的核膜(NE)包裹,核孔复合物(NPC)在核膜中形成一个通道,用于在细胞质和细胞核之间选择性交换大分子。NPC 是具有 8 倍对称性的圆柱形组件,其组成部分与许多人类疾病有关,包括癌症、病毒感染等。NPC 是真核细胞中最庞大,最复杂的分子机器之一,将 NPC 中的许多蛋白质组装成正确的三维分子结构一直是一个巨大的挑战。 2022 年 6 月 10 日,西湖大学施一公团队在 Science 杂志发表研究论文 Structure of the cytoplasmic ring of the Xenopus laevis nuclear pore complex。 该研究聚焦于非洲爪蟾核孔复合物(NPC)结构,首次扩展了脊椎动物细胞质环(CR)亚单位复合体模型的分子量,获得高分辨率的单粒子冷冻电镜显微结构。除了解析 Y 复合物,同时发现 5 个核孔蛋白 Nup358、2 个 Nup2

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限制饮食可保护视力,并延长寿命!Nature 子刊揭示:眼睛内的生物钟,或是调节长寿的开关

眼睛是感受光的重要器官,通过眼睛,我们欣赏日升月落,感受昼夜转变。同时,眼睛中的许多重要过程也会受到昼夜节律的调节。以前已有研究表明,眼睛的健康与全身的健康状况存在关联。 饮食限制是目前在多种模式动物中验证过的最为有效的改善健康状况和延长寿命的方法之一,并且限制饮食会影响昼夜节律。但饮食、眼睛健康、昼夜节律与寿命之间的联系尚未被揭示。 2022 年 6 月 7 日,来自美国巴克衰老研究所 Pankaj Kapahi 团队,在 Nature Communications 上发表了题为 Dietary restriction and the transcription factor clock delay eye aging to extend lifespan in Drosophila Melanogaster 的研究性论文,首次证明了果蝇的饮食、昼夜节律、眼睛健康和寿命之间的联系,意外地发现眼睛在影响寿命方面也起着重要作用,揭示了眼睛功能如何适应饮食限制以延长寿命。 改变核心生物钟基因 CLK,会加速视觉衰老,诱导全身免疫反应,并缩短寿命,而受到饮食限制的果蝇可以免受光感受器激活的寿

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有氧运动真的能抗癌!Cancer Cell:一周 5 次、每次 30 分钟,就可助力免疫系统杀死癌细胞

胰腺癌(PDAC)素有「癌王」之称, 据神刊 CA:A Cancer Journal for Clinicians 发布的数据显示,胰腺癌发病率低而死亡率却高居所有肿瘤中第三,一直以来科学家都对它束手无策。然而,最新发表在 Cancer Cell 上的文章却发现,简单的有氧运动就能提高机体对胰腺癌细胞的免疫杀伤!图 1:小鼠运动模型(图片来源:Cancer Cell) 2022 年 6 月 3 日,来自美国纽约大学、MD 安德森医学中心的研究工作者在 Cancer Cell 在线发表题为 Exercise-induced engagement of the IL-15/IL15-Rα axis promotes anti-tumor immunity in pancreatic cancer 的文章,研究发现本是针对细菌性侵入的哺乳动物免疫系统竟可以识别癌症细胞,而运动诱导的肾上腺素分泌上升调节对白介素 15(IL-15)有响应的免疫细胞,从而延缓胰腺癌在小鼠上的增殖。IL-15 超级激动剂 NIZ985 可模拟运动产生的有益效果,使「癌王」对免疫治疗敏感。图片来源:Cancer Ce

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技术分享 ▏个性化修饰性抗体技术解读之泛素化抗体

今天和小编一起关注更具独特性的抗体制备方法和抗体应用方向。泛素和泛素化泛素(ubiquitin,Ub)是一种小分子多肽,由76个氨基酸组成并广泛分布于真核细胞中。其主要功能是非底物特异性的标记需要降解的蛋白质,主要存在形式包括:游离的泛素、多泛素链、泛素化蛋白;不同形式存在的泛素含量反映了细胞的不同生理状态。不同类型的泛素化泛素化是指泛素分子在一系列特殊酶(如泛素激活酶、结合酶、连结酶、降解酶等)的作用下,将细胞内 ...

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选择WB(Western Blot)底物显色方法的关键

Western Blot(WB)又称蛋白质免疫印迹法,是基于蛋白质SDS-PAGE电泳分离和特异性抗体识别蛋白的特性,通过显色技术检测目的蛋白的技术。该技术主要应用于以下场景:(1)检测目标蛋白;(2)定量或定性地确定细胞或组织中蛋白质的表达;(3)用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA和蛋白质-RNA相互作用的后续分析。实验步骤多,关键点多,耗时长,每一步都可能影响实验最终结果,小编今天主要为大家介绍WB底物显色方法的选择。底 ...

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选错牙膏还会伤肠道?Nature 子刊:小心!牙膏中的这种抑菌成分会引发肠道炎症

起三氯生(triclosan,TCS)这个化学名称,对于大多数中国消费者来说还非常陌生。普通人很少知道,三氯生是一种广谱抗菌剂,广泛被添加在牙膏、肥皂、除臭剂、漱口水、剃须膏等日化用品中。其中,牙膏更是三氯生的添加「大户」。 在 2016 年,美国食品和药物管理局下令将三氯生从家庭和医院环境中使用的洗手产品中移除,主要原因是考虑到三氯生会导致更多的耐药细菌。事实上,有关三氯生安全性的争论一直存在,早在 2005 年就曾有过关于三氯生牙膏安全性存疑的新闻。 2021 年 1 月 10 日,由北卡罗来纳大学教堂山分校、马萨诸塞大学阿默斯特分校和香港浸会大学领导的一个国际研究小组,在 Nature Communications 上发表了题为 Microbial enzymes induce colitis by reactivating triclosan in the mouse gastrointestinal tract 的研究性论文,在小鼠上进行研究,证明了三氯生如何引发肠道炎症。研究内容 小鼠肠道中独特的三氯生代谢谱 研究者首先试图确定肠道是否表现出与其他组织不同的三氯生代谢特征。

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Sci Adv:中山大学柳夏林团队发现可有效治疗 GVHD 相关性干眼的新疗法

近日,中山大学中山眼科中心的柳夏林教授团队在国际著名期刊 Science Advances 杂志上以 Research article 发表题为 miR-204-containing exosomes ameliorate GVHD-associated dry eye disease 的研究论文,首次报道了富含 miR-204 的外泌体可有效缓解慢性移植物抗宿主病相关性干眼症状和体征,并发现间充质干细胞外泌体(MSC-exo)通过其富含的 miR-204 靶向调控眼表巨噬细胞,重塑眼表微环境,缓解慢性移植物抗宿主病相关性干眼,为干预这类难治性干眼疾病提供新策略。慢性移植物抗宿主病(cGVHD)相关性干眼是造血干细胞移植后的主要并发症,40%-90% 的 cGVHD 患者有干眼症表现,多诉眼干涩、异物感、疼痛、视物不清甚至引起失明,症状迁延不愈,严重影响患者的生活质量,临床上目前主要应用激素、免疫抑制剂、人工泪液等治疗,疗效欠佳,属于难治性干眼。由于 cGVHD 干眼发病机制复杂,现阶段缺乏满意的疗法,亟需探寻更有效的治疗方式。间充质干细胞(Mesenchymal stromal ce

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喝完「无糖饮料」还想吃甜食?原来人们对糖的渴望,无法被甜味剂替代,答案都在肠道里!

随着全球肥胖症的日益严重,含人工甜味剂的「无糖饮料」越来越受到广大消费者的青睐。它们被宣传只含有很少的热量甚至零热量,不仅满足了消费者对甜味的渴望,而且还不用担心会发胖,因此深受大家的喜爱。然而,这可能仅仅是一场空欢喜。2021 年 9 月 28 日,发表在 JAMA Network Open 上的一项研究,来自美国南加州大学凯克医学院领导的研究团队,发现女性和肥胖者可能对人工甜味剂更加敏感。这就意味着人工甜味饮料反而会让他们感到饥饿,食欲大开,吃得更多,从而导致体重增加。大量研究表明,人类和动物更喜欢营养糖,而不是无热量的甜味剂。二十年前,在小鼠口中发现甜味感受器后不久,科学家们试图敲除这些味蕾,但令人惊讶的是,即使没有味觉,老鼠仍然能以某种方式辨别天然糖,而且他们更喜欢天然糖,而不是人造甜味剂。那么为什么人造甜味剂不能抑制人们对糖的渴望呢?最近的研究,为我们揭开了这个谜题的答案。2022 年 1 月 13 日,来自美国杜克大学的 Diego V. Bohórquez 团队在 Nature Neuroscience 杂志上发表了题为 The preference for sugar

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诺奖得主 Jennifer 最新研究:CRISPR/Cas12c 无需切割 DNA 就可实现基因沉默,抵御病毒入侵

导读 CRISPR/Cas 系统为细菌提供了适应性免疫,同时其准确识别和切割特定 DNA 和 RNA 序列的能力也为植物、动物和微生物基因组编辑提供了强大的工具。目前,基于 CRISPR-Cas9 基因编辑的多项临床实验也已启动并获得突破性结果,为许多遗传疾病的治疗开辟了新的途径。 德国马克斯·普朗克病原学研究所的 Emmanuelle Charpentier 以及美国加州大学伯克利分校的 Jennifer A. Doudna 也因为开发了这一最重要的基因组编辑方法而摘得 2020 年诺贝尔化学奖的桂冠。 近年来,CRISPR/Cas 相关的研究也取得巨大的进展,其中多项研究均发现了一个包含 RuvC 的 Cas 蛋白家族,被称为 Cas12,其变体表现出不同的生化和细胞活性。 其中,Cas12c 最初发现于肠道宏基因组的小 DNA 片段中,虽然与其他 DNA 切割 Cas12 酶存在共同的特征,但这种蛋白质的一些生化特性仍然是未知的:比如其 RNA 识别和加工的机制尚不清楚;此外,由于缺乏可检测到的 DNA 酶活性,Cas12c 是否或如何为细菌提供抗病毒保护仍然是有待回答的问题。

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中国团队最新研究揭示:喝适量加糖的咖啡,可降低死亡风险

咖啡是全球消费最广泛的饮料之一,人们对其健康影响的兴趣由来已久。已有研究表明,咖啡可能会降低心血管疾病、2 型糖尿病、阿尔茨海默病、癌症等疾病风险,并表明咖啡摄入量与降低死亡风险之间存在关联。 但是,在过去的研究中,并没有对无糖咖啡与加糖/人造甜味剂的咖啡进行区分。而在日常生活中,许多人会选择加入糖来掩盖黑咖啡原有的苦味。那么,加糖之后的咖啡,会对健康有什么影响呢? 为了评估不加糖的、加糖的和加人造甜味剂的咖啡与全因和特定原因死亡率之间的关系,来自中国南方医科大学的毛琛团队进行了相关研究,并于 2022 年 5 月 31 日在 Annals of Internal Medicine(IF = 25.391)上发表了题为 Association of Sugar-Sweetened, Artificially Sweetened, and Unsweetened Coffee Consumption With All-Cause and Cause-Specific Mortality 的论文。 研究发现,适量摄入加糖咖啡可能对人没有坏处。在 7 年的随访期间,与不喝咖啡的人相比,喝适量

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今日 Science 特刊!6 文齐发:人类与微生物的「爱恨情仇」,科学家有了哪些新的认识

生命早期的免疫微生物相互作用:长期健康和免疫疾病的决定因素人体是丰富多样的微生物(细菌、病毒、真菌等)的宿主,彼此之间形成了非常复杂的关系网络。大部分微生物组存在于肠道中,皮肤、口、鼻、肺、生殖道中也都存在不同的微生物群落。人体微生物组在维持体内平衡方面具有重要作用,已有不少研究揭示了微生物群对人体健康的重要影响。今日,Science 杂志推出了微生物群的相关特刊,三篇观点文章和三篇综述概述了目前对各种人类微生物群落的理解,并探讨了有待发现的内容。「了解生态以及宿主与其微生物群之间的交叉对话机制,提供了一种更全面的人类健康观,未来将有助于预防和治疗一系列人类疾病」,Science 高级编辑 Priscilla Kelly 这样写道 [1]。6 篇文章从微生物群-脑轴、口腔微生物、皮肤微生物等多个角度展开。微生物群-脑轴在 John Cryan 和 Sarkis Mazmanian 撰写的观点文章中,强调了肠道细菌与大脑发育和功能之间的关系,包括动物的情绪、运动和认知行为。虽然越来越多的研究说明了这些联系,但微生物群——脑轴中涉及的潜在机制和途径尚未完全了解 [2]。图片来源:参考文献

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免疫荧光实验指南

固定和透化 在培养板中将已爬好细胞的盖玻片用 1 × PBS 浸洗 3 次,每次 3 min。 用 4% 的多聚甲醛固定爬片 15 min,1 × PBS 浸洗玻片 3次,每次 3 min。 0.5%Triton X-100(1× PBS 配制 )室温通透细胞 15 min(细胞膜上表达的抗原省略此步骤), 1 × PBS 浸洗玻片 3 次,每次 3 min。封闭吸水纸吸干 1 ×PBS,在玻片上滴加 5% 的正常血清(与二抗种属来源一致或相似),室温封闭 1 h。抗体孵育 吸水纸吸掉封闭液,不洗,每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒,4 ℃ 孵育过夜。加荧光二抗: PBST 浸洗爬片 3 次,每次 3 min,吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗,湿盒中 37℃ 孵育 1 h,PBST 浸洗爬片 3 次,每次 3 min。注意:从加荧光二抗起,后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。固定拍照 复染核:滴加 DAPI 避光孵育 5 min,对标本进行染核,PBST 5 min×4 次洗去多余的 DAPI。 用吸水纸吸干爬片上的液体,用含抗荧光淬灭剂的封片液

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投稿前先给期刊编辑发个邮件,说不定文章接收的更快哦!

完成投稿后,早期可能会有编辑联系格式更改事宜,然后就进入了漫长的等待。有一种情况,经过几天乃至数周后,收到了稿件转投建议(Journal Transfer Recommended)或因与期刊 Scope 不契合而直接被拒稿。随着转投他刊,意味着文章格式、图标部署和行文思路等都将进行一定程度的修改,这一过程浪费了许多时间。因此,可以在正式 Submission 之前,给目标期刊写封邮件,进行一次 Pre-submission enquiry。在初步调查并选定目标期刊后,可以通过邮件询问的形式(个别期刊或特刊也会开放相应的系统或由组稿编辑直接负责,如 Nature、NEJM 和 Frontiers 系列期刊等)来了解期刊是否对这篇论文感兴趣。与正式投稿不同,Pre-submission enquiry 可以有针对性地写给多家心仪期刊,根据答复情况再进行正式投稿。这种咨询对自己较为熟悉的、经常投稿的领域或期刊帮助不大,而对于交叉学科、新接触的领域、新的研究技术、非约稿的综述、期刊强制要求(如 NEJM 的某些板块)和其他拿不准的情况大有裨益。 一、主要内容一封 Pre-submission

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