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第一章 质粒DNA的分离、纯化和鉴定 第一节 概 述　　把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。 　　质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所 ...

摘要:腺相关病毒(AAV)是一种人细小病毒，目前因为能作为一种基因治疗载体而受到广泛关注。构建重组AAV(rAAV)涉及到用一个目的基因替换病毒基因组的大部分，然后将这个重组基因组包装到一个有感染性的病毒颗粒里。目前大多数生成rAAV的实验方案需要共转染一个载体质粒和一个表达病毒复制和结构基因的包装质粒到腺病毒(Ad)感染的培养细胞中。此方法的局限性包括(1) Ad辅助病毒污染rAAV，(2)rAAV的低产出，(3)生成 ...

祝贺gb2003、wh2008成为《实验技术中的惑与获》一书主编！期待他们的作品早日问世！*****************************************************************************主编征集活动回顾：全园征集主编：丁香园联手人民卫生出版社打造《实验技术中的惑与获》一书在实验过程中，你是否曾经有过诸多“困惑”？在消除困惑的过程中，你取得了哪些“收获”？和大家分享你在实验过程中的惑与获，启示后来人！ 实验技术的设计和操作是一个不断探索与 ...

《分子克隆参考》编写已经进入收稿阶段，请各位战友抓紧时间编写，计划在年底前出书，收稿截止至12月15日。已经PM给报名参加撰写的战友，请将文稿用word发送至我的邮件，或以附件形式贴在跟帖中。同时希望你们在以下贴中回帖，以便加分（初步定为5分）和核实内容，违期将示为自动放权，谢谢您的合作！请各位斑竹根据目前收稿情况选择几章较熟悉的，然后我再具体安排章节进行校正审稿，特殊章节（不属于实验技术范畴）再讨论，也请战友投稿 ...

玛丽和乔是一对孪生子，她们拥有相同的遗传学特征而且共同生活在一个幸福的家庭里。随着他们的不断成长，两个人都非常喜爱体育和艺术，同样学习成绩优良而且几乎在每一个方面哪怕是细节方面都显示出了惊人的相似。然而等到成年以后，她们的生活和个性却产生了明显的差异：在玛丽二十岁出头的时候，一件恶梦般的事情发生了，她被诊断患有精神分裂症。类似这样的例子长期以来一直使遗传学家们感到困惑：尽管拥有相同的DNA甚至常常是同样的成 ...

1. 什么是Reads?高通量测序平台产生的序列就称为reads。2. 什么是Contig？拼接软件基于reads之间的overlap区，拼接获得的序列称为Contig（重叠群）。3. 什么是Scaffold？基因组de novo测序，通过reads拼接获得Contigs后，往往还需要构建454 Paired-end库或Illumina Mate-pair库，以获得一定大小片段（如3Kb、6Kb、10Kb、20Kb）两端的序列。基于这些序列， ...

15天构建三个重组质粒经验－－态度决定成败－－献给刚刚进入实验室的新战友前言：我自己的课题是单克隆抗体的制备及其初步应用，总共花了六个月的时间基本做完。做完了之后我想现在单抗的文章不可能发到比较好的杂志，就想能不能利用剩下的将近一年的时间来再做一个比较好的课题。下面是从我的试验记录上面摘抄的一部分，也就是构建载体的这一段时间所记录的东西。第一天：同实验室的一位同学是做某蛋白上面的一段的免疫活性的研究，我就像我 ...

真核细胞的mRNA在加工过程中有一个比喻为“穿鞋戴帽”的过程，因此mRNA的3'末端都带有一段Poly A，这是利用逆转录酶制备cDNA文库的基础。但是由于cDNA的5'端的序列各不相同，如何获得全长的cDNA，如何扩增由微量的mRNA逆转录得到的cDNA文库、如何利用已知片断序列得到全长的cDNA（即RACE），曾经是一个令人困扰的问题。常见的做法是在合成cDNA的双链后在两端连上接头，利用已知的接头序列再进行扩增 ...

第一章　质粒DNA的碱裂解法提取与纯化——【核酸基因技术版】已有zein 和newdragon 编写初稿，请两位战友商量并及时更新，采用一个版本！第二章　基因组DNA的碱裂解法提取与纯化——【核酸基因技术版】已有zein 编写初稿，请及时更新！第三章　真核细胞DNA的制备与定量——【核酸基因技术版】已有yujz149 编写初稿，请及时更新！第四章 噬菌体DNA提取——【核酸基因技术版】第五章　核酸电泳——【核酸基因技术版】已有wangjun报名 编写初稿！第六章　感受 ...

本人倾情上传本校基因工程专业的试题及答案。作为送给核酸技术讨论版的礼物。希望版主加分。基因工程与基因体外表达练习题及其答案一、填空题1． 基因工程是_________年代发展起来的遗传学的一个分支学科。2． 基因工程的两个基本特点是： (1)____________，(2)___________。3． 基因克隆中三个基本要点是：___________；_________和__________。4． 通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小 的片段，可以构建显示该区域各 ...

原理： 如何获得高的大肠杆菌感受态——可算是【一块砖头】吧 感受超级感受态细胞的制备 感受超级感受态细胞的制备1 超级感受态制备2 E.coli感受态：一步法制备感受态： 一步法制感受态急－关于感受态细胞 关于一步法制感受态的疑问 我所用过的最简单的制备感受态的方法！CaCl2法： 感受态细胞的制备 【鸡毛蒜皮】之6 Ultra-感受态 交流：大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法 因为最近数次制作感受态转染生长失败，求助精英们的标准制作方法。多谢！ 分子克隆第三版中感受态 ...

本人做的植物转基因技术方向，由于要做一些杂交技术来验证外源基因的整合与表达情况，故将自己在做实验中遇到的一些问题以及注意事项想告诉大家，同时希望和朋友们一起交流探讨。Southern Blot:1.首先是提取大量DNA，由于不同的材料的基因组大小不一样，故上样量也不同，但上样量还是要大一些为好，一般30-50微克左右，若你的DNA质量非常好，一般20微克左右就可以，有的材料如獐茅10微克就可以。注意，上样量与DNA质 ...

精华【连接转化讨论专栏】 连接反应大全 【鸡毛蒜皮】之5－连接反应中巧用内切酶 连接技术讨论区PCR与连接PCR连接关于PCR产物及酶切产物与载体的连接 PCR产物与表达载体连接的问题PCR产物能够直接用做T-载体的连接吗平端连接 平端连接高手（讨论专贴）平端连接平端连接的怪现象? 平端连接的怪现象(2)平末端连接的条件？ 平末端连接构建载体的一些个人经验连接问题集 连接的问题关于连接偶的连接问题！还是连接问题求助：DNA连接问题关于连接的 ...

在哺乳动物细胞中进行RNA干扰:设计，实验和分析siRNA效应转录后基因沉默，也称为RNA干扰，是指双链RNA分子阻断或者降低同源基因的表达的现象。这种现象可能是作为一种抑制病毒感染和转座子跳跃的细胞防御机制(Ketting et. al., 1999; Tabara et. al., 1999; Jensenet. al., 1999; Ratcliff et. al., 1999)。在体内，双链RNA被内源的核糖核酸酶降解为21-23个碱基大小的小分子干扰RNA（small i ...

目的:构建目的基因的真核表达载体 历时整整一学期,期间经历了很多挫折,遇到很多问题,也从中学到很多经验.借寒假的时间写了写我一学期构建的经历,把我的一点经验拿出来和大家分享讨论.分步来说:一.PCR扩增得到目的片段1.引物的设计与合成:这里有很多血与泪的教训。我前后一共送过九个载体测序，其中居然有五个是引物出错。最后一次挑的两个克隆都是上游引物出错（此上游引物40个碱基） ，后来和这家引物公司交涉，他们拿走了我的板子，一次 ...

核酸、核苷酸的基本换算DNA电泳基本参数Pfu DNA聚合酶BCIP/NBT & BCIP/INTHistoChoice MBHistoChoice Clearing Agent核酸、核苷酸的基本换算1．核酸的换算：(1)摩尔数与质量：1 μg 1,000bp DNA = 1.52 pmol1 μg pUC18/19 DNA (2,688bp) = 0.57 pmol1 μg pBR322 DNA (4,361bp) = 0.35 pmol1 μg SV40 DNA (5,243bp) = 0.29 pmol1 μg FX174 DNA (5,386bp) = 0.28 pmo ...

我用附件传不上来，只能用这种笨法了，希望大家用的上　　近年来的研究表明，将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。这种转录后基因沉默机制(post-transcriptional gene silencing, PTGS)被称为RNA干扰（RNAi）。 　　一、RNAi的分子机制　　通过生化和遗传学研究表明，RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(initita ...

最近，摸索了一下PEG沉淀PCR产物的方法，贴出来，与大家共享。摸索这个方法的目的主要是，探索一种方法，能将PCR产物大批量地、廉价地、纯度比较高地纯化出来，并且最好能去掉200bp以下的小片段DNA，用于DNA测序。有文献和方法说，不同浓度的PEG能沉淀不同长度的DNA，所以，先做了一下不同PEG浓度对DNA沉淀的作用，见下图，标本是用的50bp DNA Marker，上一行Marker溶解在纯水里面的，下一行Marke ...

第一节 基因和基因组一、基因(gene)是合成一种功能蛋白或RNA分子所必须的全部DNA序列．一个典型的真核基因包括①编码序列—外显子(exon)②插入外显子之间的非编码序列—内合子(intron)③5'-端和3'-端非翻译区(UTR)④调控序列(可位于上述三种序列中)绝大多数真核基因是断裂基因(split-gene)，外显子不连续。二、基因组(genome)一特定生物体的整套(单倍体)遗传物质的总和，基因组的大小用全部DNA的碱基 ...

半个月前我正式进入实验室学习，老实说，这半个月是痛苦的，也让我感受颇多，这里我愿意把自己的心得和大家分享，尤其希望对那些和我一样刚进实验室或将要进的园友有点帮助。今年是我研究生的第二年，第一年是理论学习，没有进实验室，我老板是领导，脱离科研好多年了，对我们的学习几乎没什么指导，对这一阶段，我的惨痛教训如下：⒈学习，学习，努力学习，千万别逃课，崩管老师好不好，听听总好，说不定什么时候就有启发，千千万万是那门分子生物学及技 ...