脂质体说明书

以下是我翻译的脂质体说明书，请多指教
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Invitrogen
LipofectamineTM 2000
Cat. No. 11668-027 Size: 0.75 ml
Cat. No. 11668-019 Size: 1.5 ml
含量及保存：
LipofectamineTM 2000 为液态，浓度为1mg/ml。储存在4℃，注意不能冻存。
重要原则：
进行转染时应遵循下面的原则：
1．  对大多数细胞来说，DNA(ug)与脂质体(ul)混合的比例应为1:2至1:3。例如：对24孔板中一个孔的细胞（0.5-2×105）来说，需0.8-1ug DNA和2-3ul 脂质体。
2．  推荐细胞在转染前密度应达到90%-95%，这关系到转染的效率。
3．  转染用培养基不应加抗生素，以避免造成细胞死亡。
为取得满意结果，我们有以下建议：
1．  在与DNA混合前，使用Opti-MEM I Reduced Serum Medium(Catalog no. 31985-062) 稀释脂质体。其他无血清培养基（如D-MEM）也可用来稀释脂质体。
2．  测试无血清培养基中组份与脂质体的相容性，因为某些组份可抑制阳离子脂质体介导的转染，如CD293, 293SFM II, VP-SFM。
转染步骤：
这里以24孔板为例介绍转染步骤
1．  贴壁细胞：转染前一天，每孔中加入0.5-2×105细胞和500ul无抗生素的培养基，以至于转染时细胞可达到90%-95%融合。
悬浮细胞：转染当天每孔加4-8×105细胞和500ul无抗生素的培养基。
2．  对每种转染样本准备以下DNA-脂质体混合物：
a.  用50ul无血清培养基稀释DNA，轻轻混匀。
b.  在使用前临时将所需的适量脂质体用50ul无血清培养基稀释，轻轻混匀，室温孵育5分钟。注意：稀释的脂质体应在30分钟内与稀释的DNA混合。长时间的孵育会降低脂质体活性。如果用D-MEM作为脂质体的稀释剂，那么应在5分钟内与稀释的DNA混合。
c.  孵育5分钟后，将稀释的DNA和稀释的脂质体混合（总体积100ul），轻轻混合，室温孵育20分钟以利于DNA-脂质体复合物形成。溶液可能出现絮状，但并不会抑制转染。注意：DNA-脂质体复合物室温下6小时内可保持稳定。
3．  将100ul DNA-脂质体复合物加入到含细胞和培养基的培养孔中，震荡培养板轻轻混合。
4．  在37℃ CO2孵箱中培养24-48小时，这是可以分析基因瞬时表达。这期间去除复合物或更换培养基是不必要的；然而，4-6小时后更换培养基也不会影响转染效果。
5．  稳定转染：转染24小时后将细胞以1：10或更大的稀释比例传到新鲜的培养基中，培养基中加入筛选剂。
悬浮细胞：在加入DNA-脂质体复合物4小时后加入PMA和/或PHA。提示：对Jurkat细胞来说，PHA-L和PMA的终浓度分别为1ug/ml和50ng/ml，这可以提高CMV启动子活性和基因表达效率。对K562细胞来说，只加PMA足以提高启动子活性。