【交流】AFLP
丁香园论坛
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我现在正在做的是AFLP方面的东西，结果检测必须要做变性胶电泳才能看到，但是前一阵子我做的一直不顺，条带少，我试着减少引物的筛选个数和降低退火温度结果还是这样，一时不知道从何处找原因，想求教你的是
1、先看看我前两天做的变性胶电泳图片，条带太少，我看到的文献都是说条带在50到100的样子，为什么我跑的是这样子的呢，我做了减少引物的筛选碱基的个数和降低退火温度，结果还是差不多，请问各位做过AFLP的或者是跑变性聚丙烯酰胺的高手，指点一下问题可能出在什么方面，怎么去解决呢
2、做变性胶所用的丙烯酰胺和Bis 要求什么纯的比较好，是测序用的那种胶还是普通的跑蛋白电泳PAGE 胶，我所用的就是后者，不知道是不是有所影响？
3、 我在一份PROTOCOL中看到这样的预扩增程序：
72 ˚C 2min
94 ˚C 30 sec
56 ˚C 30 sec
72 ˚C 2 min
Goto 2 29 more times
60 ˚C 10 min
25 or 4 ˚C hold
他给出的解释是这样的：The T4 DNA ligase only ligates one of the strands of the adapter to the fragment. The other is held on by base-pair binding to the other adapter strand. Thus the first step of the +1 PCR reaction is a 72 ˚C hold that allows the Taq polymerase to ligate the other strand. If you perform a Hot-Start, or place the +1 reactions into a hot thermal-cycler, or omit the initial 72 ˚C hold, you will loose the second strand and the PCR reaction won’t work. Do not use AmpliTaq Gold for +1 reactions as the Taq will not be active in the initial 72 ˚C hold.
但是我不太懂，我想问的是T4 DNA ligase 不是直接就可以连接粘性末端的么？
1、先看看我前两天做的变性胶电泳图片，条带太少，我看到的文献都是说条带在50到100的样子，为什么我跑的是这样子的呢，我做了减少引物的筛选碱基的个数和降低退火温度，结果还是差不多，请问各位做过AFLP的或者是跑变性聚丙烯酰胺的高手，指点一下问题可能出在什么方面，怎么去解决呢
2、做变性胶所用的丙烯酰胺和Bis 要求什么纯的比较好，是测序用的那种胶还是普通的跑蛋白电泳PAGE 胶，我所用的就是后者，不知道是不是有所影响？
3、 我在一份PROTOCOL中看到这样的预扩增程序：
72 ˚C 2min
94 ˚C 30 sec
56 ˚C 30 sec
72 ˚C 2 min
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60 ˚C 10 min
25 or 4 ˚C hold
他给出的解释是这样的：The T4 DNA ligase only ligates one of the strands of the adapter to the fragment. The other is held on by base-pair binding to the other adapter strand. Thus the first step of the +1 PCR reaction is a 72 ˚C hold that allows the Taq polymerase to ligate the other strand. If you perform a Hot-Start, or place the +1 reactions into a hot thermal-cycler, or omit the initial 72 ˚C hold, you will loose the second strand and the PCR reaction won’t work. Do not use AmpliTaq Gold for +1 reactions as the Taq will not be active in the initial 72 ˚C hold.
但是我不太懂，我想问的是T4 DNA ligase 不是直接就可以连接粘性末端的么？
