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做了快一年的分子克隆，犯了很多错误，经历了很多坎坷，也学到了很多东西。分子克隆过程中出现问题最多的大概就是连接了，大家抱怨的也最多，我也陷入在个步骤上很久。经过长时间的摸索我在连接这个问题上有一些体会，在这里跟大家分享一下我的经验，以供和我一样陷入困境及刚开始做克隆的同学参考。关于连接的提问多集中在连接的体系、DNA的用量、vector和insert的比例、连接酶等。但是我认为，连接不成功，问题并不一定出在连接这 ...

　　　技术答疑——“血液基因组提取”　张老师，天根特邀专家。分子生物学博士，具有10多年的分子生物学领域的研究经验。熟悉各种分子生物学实验技术。在我们的沟通中，张老师始终强调：“核酸提取是分子生物学实验的第一步，良好的开始是成功一半。”张老师希望通过丁香园论坛，就基因组提取技术方面与大家共同探讨。以下请站友们就“血液全基因组提取”及相关问题跟帖提问，张老师将作阶段性答复。答疑流程1、提问时间：2009.4.15～2008.4.30；2、 ...

写在前面的话：近一段时间由于参与了院子里的管理，接触到了更多的帖子，感触良多。大家好象都习惯于发帖提问，而很少去浏览一下以前的帖子，但然也有一些资源太多了，寻找起来太麻烦。不过看到一些帖子在那里挂了几天没人应也不愿搜搜的就实在无法理解了。就象才进院子里的新手很关心自己下载资源的权限，只要一看到什么资源就下，至于有没有看那就是另一回事了。鉴于此，我们决定开一个热门问题的专帖来讨论这个问题集中以下并并把它作为静态 ...

放到“精华”帖子中，以期能进一步深入讨论。请大家积极发言，谈谈自己的体会。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction ,PCR)是一种利用耐热的DNA聚合酶在体外扩增DNA的方法,为最常用的分子生物学技术之一。典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。当DNA长度小于2kb时，一般PCR反应都问题不大，均较容 ...

.miRNA实验技术答疑专场microRNA（miRNA）作为非编码RNA的代表，是目前表观遗传学研究的热门领域。miRNA在生物体内发挥着重大的调控作用。通过对靶蛋白转录或翻译过程的抑制，miRNA参与调节细胞增殖、分化、代谢等各个生理过程。此外，miRNA在疾病的调控中发挥重要作用，特别是其可以行使原癌基因或抑癌基因的功能，影响癌症的发生、发展和迁移。由于miRNA含有的核苷酸数量较少，在提取、逆转录和荧光定 ...

LIPOFECTAMINE 2000转染试剂转染步骤此实验步骤设计用来进行24孔板贴壁细胞的瞬时或稳定转染，其为设计用来在生长培养基中直接加入复合物。1. 转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90%。细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中（参见表6了解建议的细胞密度）。2. 对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释0.8μg-1.0μg DNA。多孔操作可以批 ...

这是根据我写的一个PPT摘录的，希望能有朋友讨论这方面的问题。并拓宽这个领域，讨论epigenetics更广泛的问题。毕竟epigenetics是现在动物功能基因组研究的主流和一个重要方向。1. 印迹基因的概念及重要意义概念:基因组印迹是特指来源于亲本的等位基因进行不对称后成修饰后而导致的单等位基因表达的现象。这种在生物进化中形成的、有规律而又受控的基因失活是机体中基因表达调节的一种重要方式。2. 研究印迹基因的重 ...

本人在做RNA抽提实验中总结了一些需要注意的事项，以及一些抽提各种RNA的常用方法及步骤。希望与大家共同分享：高质量的真核生物mＲＮＡ的提取， 必须使用ＲＮＡ酶的抑制剂或采用下述的破碎细胞和灭活ＲＮＡ酶同步进行的方法，最大限度地降低细胞破碎过程中所释放的ＲＮＡ酶的活性。同时，避免偶然引入实验室内其他潜在的痕量ＲＮＡ酶也很重要。下面列举避免ＲＮＡ酶法染问题的一些注意事项。大多数有经验的研究者并不拘泥于这些注意事项 ...

最近做大抽，用的是Qiagen Maxi kit, 一开始抽提产量少，因为是公认的昂贵而好用的试剂盒，觉得是自己操作的不好。就仔细研究了说明书，及整个提取过程，得出一些经验。（high copy plasmid）1.摇菌：菌摇得好不好十分重要。整个过程，其他步骤完全按试剂盒说明操作，一般没有问题，唯独摇菌得自己操作。a.个人觉得还是先活化摇菌8h，在稀释后扩大培养较好，不要偷懒。b.摇菌量问题：试剂盒有推荐cultrue volume，我的推荐 ...

慢病毒——基因转移的潜在新载体　　用于基因治疗的载体系统可分为病毒性载体和非病毒性载体两类。目前常用的病毒载体包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、痘苗病毒载体等,但是这些载体均存在不足之处,严重影响了基因治疗的有效性及安全性。在基因治疗中广泛应用的逆转录病毒载体存在的主要问题,是无法高效转导非分裂期细胞,而腺病毒载体虽然能转导非分裂期细胞,但在体内不能实现目的基因稳定的长期表达,且反复应用容 ...

RNA的提取准备试剂：氯仿，异丙醇，75℅乙醇，无RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制)操作步骤:1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板 ...

TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol试剂有多组分分离作用,与其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚／SDS法、盐酸胍法、硫氰酸胍法等相比，最大特点是可同时分离一个样品的RNA\DNA\蛋白质．TRIzol使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可 ...

microRNA（miRNA）是一种机体内源性表达的单链小分子RNA，位于基因组非编码区，本身不具有开放阅读框（open reading frame，ORF），具有高度保守性，时序性和组织特异性。miRNA广泛存在于各种真核细胞中，不编码任何蛋白质，长度仅为20～24nt。成熟的miRNA 5′端有一个磷酸基团，3′端为羟基，由具有发夹状结构的约70～90nt的单链RNA前体经过Dicer酶加工后形成。成熟的miRNA形成RNA ...

实验很早之前做完了，总结一下银染。希望对后人有些帮助。银染技术很容易掌握，做好却需要注意一些小细节。希望我犯得这些小错误你能避开，节省宝贵的时间。本方法适当的修改了文献中的一些方法。文献在文章末已附上。——————————————华丽分割线——————————————————————————————————一、银染前准备1. 银染水质很重要，最好全部双蒸水或去离子水。2. 装胶的器皿清晰干净，最后双蒸水多冲几遍。3. 操作时戴手套，不然gel上会有大手印。4. 跑胶时我采用大梳子 ...

要求：1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。2. RT按要求做，一般不会出太大问题。3. PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c： ...

由于PCR版已经加分，本版不再加分。感谢支持！经过一段时间的RT-PCR实验，我的实验没有多大进展，但是提取RNA倒是有了一点体会，在这里写出来，与大家共同分享，希望对新手是个帮助，也希望各位战友能够批评指正，谢谢！RNA提取心得一 组织RNA提取1.最好新鲜组织，这样RNA提取的效果比较好，这是肯定的。2.如果不是新鲜的（最好在半年之内，-80°或者液氮中冻存的）组织，注意不要反复冻融，从冰冻状态拿到0-4°，注意不要拿到常温 ...

看到很多网友还在找这些相关的书籍，在这里再提供给大家。已测试可以下。文件名称: 现代分子生物学实验技术全套(第二版 卢圣栋主编) 文件格式： PDF文件大小: 55.09MBhttp://www.dxy.cn/bbs/thread/11310519文件名称: 精编分子生物学实验指南 中译本 奥斯伯 文件格式： PDF文件大小: 20.22MBhttp://down.aybook.cn/book7/aybook.cn_xiandaishengwu1012.pdf文件名称: 分子 ...

The Knowledge Foundation: RNA in drug developmenthttp://www.knowledgefoundation.com/events/5071225_p.pdfA Link Between RNA Interference and Nonsense-Mediated Decay in C. eleganshttp://www-hhmi.genetics.utah.edu/bass/papers/science00.pdfRNAi in Cup ...

标题：【申请上传】Molecular Biology of the Gene (Watson J.D., et al., 5th edition, 2004)内容：Molecular Biology格式：PDF大小：110 MB语种：英文简介：http://www.pearsoned.co.uk/Bookshop/detail.asp?item=300126#Description位置：老赵一号航母核酸基因技术区/pub/Molecular Biology of the Gene--------------- ...

此资源转自小木虫，都可以下，相当清晰，但是需要安装米人，本人测试过了。希望好心的版主可以给点积分，谢谢了先对于刚进实验室的新手来说，有太多仪器不懂，有太多操作不了解，现在把浙大基因工程实验操作讲解视频分享给大家，希望能对实验室新手有帮助~1.细菌基因组DNA的提取.wmvhttp://d.namipan.com/d/ba51df852bf4755d02e6a74a8ef3e04000f112bd57a77f042.P ...