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        转染和转染效率测定步骤

        丁香园论坛

        41103

        LIPOFECTAMINE 2000转染试剂转染步骤

        此实验步骤设计用来进行24孔板贴壁细胞的瞬时或稳定转染,其为设计用来在生长培养基中直接加入复合物。
        1. 转染前一天,胰酶消化细胞并计数,细胞铺板,使其在转染日密度为90%。细胞铺板在0.5ml含血清,不含抗生素的正常生长的培养基中。
        2. 对于每孔细胞,使用50μl无血清培养基(如OPTI-MEMⅠ培养基)稀释0.8μg-1.0μg DNA。多孔操作可以批量制备。
        3. 对于每孔细胞,使用50μl OPTI-MEMⅠ培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。LIPOFECTAMINE 2000稀释后,在30分钟内同稀释的DNA混合。保温时间过长会降低活性。可以批量制备。
        注意:即使LIPOFECTAMINE 2000使用OPTI-MEMⅠ稀释,细胞也可以使用D-MEM培养。如果D-MEM做为LIPOFECTAMINE 2000的稀释液,在5分钟内同稀释的DNA混合。
        4. 混合稀释的DNA(由第2步)和稀释的LIPOFECTAMINE 2000(由第3步)。在室温保温20分钟。
        注意:溶液可能会混浊,但不会影响转染。复合物可以在室温保持6小时稳定。

        表6. 在24孔板中转染Invitrogen细胞系的推荐使用量 Table 6
        Cell Line Cill/well(×10) LIPOFECTAMINE 2000 Reagent(µl)
        CHO-S 1.5 2.5-3.0
        COS-7L 0.8 2.5-3.0
        293H,293F 2.0 1.5-2.0

        5. 直接将复合物加入到每孔中,摇动培养板,轻轻混匀。
        注意:如果在无血清条件下转染,使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基,替换为0.5ml无血清培养基。
        6. 在37℃,5%的CO2中保温24-48小时,无须去掉复合物或更换培养基或者在4-5小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。
        7. 在细胞中加入复合物24-72小时后,分析细胞抽提物或进行原位细胞染色,检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达,在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中,两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。
        贴壁哺乳动物细胞的DNA转染步骤

        此步骤专门设计使用LIPOFECTAMINE,LIPOFECTIN,DMRIE-C或CELLFECTIN试剂在6孔板转染贴壁的哺乳动物细胞。
        使用这些试剂时,欲得到最佳转染效率,条件的优化必不可少。参考右侧阳离子脂质体试剂和DNA优化步骤。健康的,正在增生的细胞和恒定的细胞密度对于可重复性的结果不可或缺。

        1. 转染前一天,将细胞用胰酶消化、计数并铺板,使转染日细胞融合度为70-90%。在铺板和转染期间避免使用抗生素。
        2. 对每孔细胞,在100μl无血清培养基(如OPTI-MEMⅠ或D-MEM)中稀释1-2μg DNA。如有多孔细胞,可以批量制备。
        3. 在每孔中,用100μl无血清的培养基稀释2-25μl阳离子脂质体试剂。阳离子脂质体试剂的每次稀释都使用单独的管。对于LIPOFECTIN,必须使用OPTI-MEMⅠ稀释并将稀释液在室温保温30分钟。
        4. 将稀释的DNA(步骤2)同稀释的脂质体试剂(步骤3)混合。在室温保温15分钟。
        5. 使用0.8ml/孔的转染培养基在转染开始前清洗细胞。转染培养基中可以含有血清。
        6. 使用转染培养基稀释复合物至总体积1ml/管。将稀释的复合物加入细胞。5% CO2,37℃保温5小时。
        7. 5小时后,增加培养基的体积至正常体积。如果转染培养基不含血清,加入血清,使其终浓度达到正常生长培养基的浓度。如欲使细胞生长最佳,使用新鲜的完全培养基替换含有复合物的培养基。
        8. 转染24-48小时后,分析细胞抽提物或进行原位细胞染色,检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达,在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中,两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。
        注意:当转染不同大小培养板中的细胞时,根据表面积相应改变细胞,DNA,转染试剂以及培养基的量。

        阳离子脂质体试剂和DNA的优化步骤

        当使用除LIPOFECTAMINE PLUS试剂外的其他阳离子脂质体试剂进行转染时,如欲得到最佳转染效率,精心的优化必不可少。本实验步骤可以确定使用LIPOFECTIN,CELLFECTIN,DMRIE-C或LIPOFECTAMINE试剂所需的最佳脂质体试剂和DNA的量。

        保持恒定的细胞密度以得到可重复的结果。阳离子脂质体试剂和DNA复合物在96孔板中制备(因为体积很小),然后加入24孔板中生长的细胞。转染的培养板按如下方式设置:

        1. 转染前一天在24孔板中进行细胞铺板,使转染日细胞融合度为70-90%。
        2. 在6个小离心管中,根据下表使用无血清培养基稀释阳离子脂质体试剂(其足够用于5孔细胞转染)。仅对LIPOFECTIN试剂,需要在室温保温稀释液30分钟。

        Tube/Colum(µl) Volume Dilution Medium(µl) Volume Cationic Lipid Reagent
        1 120 5
        2 117.5 7.5
        3 115 10
        4 112.5 12.5
        5 110 15
        6 107.5 17.5

        3. 将25μl稀释的阳离子脂质体试剂(步骤2)加入96孔板相应列的4个孔中(如上面图表)。
        4. 在小离心管中,在140μl无血清培养基中加入下列量的DNA进行稀释。(足够用于7孔细胞转染。)

        Tube/Row DNA(µg)
        A 1.4
        B 2.8
        C 5.6
        D 8.4

        5. 在96孔板上每隔6孔(沿底部),在管A取出20μl加入。对管B,C和D重复同样步骤。将样品按上面图表所示排布。在室温保温15分钟。
        6. 将要转染前,使用新鲜转染培养基清洗细胞。在加入稀释的复合物(步骤7)前除去清洗液。
        7. 在含有DNA-阳离子脂质体试剂复合物的96孔板上,每孔加入160μl转染培养基(含有或不含有血清)。稍加混合。建议检测有无血清存在时的活性。
        8. 将复合物加到24孔板的细胞中。
        9. 5%CO2,37℃保温5小时。5小时后,加入含血清的完全培养基,使血清终浓度等同于正常生长培养基。如欲使细胞生长最佳,使用新鲜的完全培养基替换含有复合物的培养基。
        10. 转染24-48小时后,分析细胞抽提物或进行原位细胞染色,检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达,在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中,两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。

        注意:一旦确定了优化的条件,转染实验可以根据培养板表面积增加的比例线性放大。6孔板中得到的优化条件已经成功放大到100mm平皿上。建议的阳离子脂质体和DNA量的范围列在下面。

        表11. 使用LIPOFECTIN,CELLFECTIN,DMRIE-C或LIPOFECTAMINE试剂进行转染的用量范围 Table 11
        Culture Vessel DNA(µg) Cationic Lipid Reagent(µl) Transfection Medium Volume
        35-mm 1-2 2-25 0.8
        60-mm 3-6 6-75 2.4
        100-mm 8-16 16-200

        转染细胞的β-gal原位染色

        1. 此实验步骤针对固定细胞β-gal表达的检测。这是用来确定转染效率的方便快捷的方法。此方法在6孔板上进行,由Sanes的方法修正而来。对于不同大小的培养器皿,根据培养板的表面积比来扩大或缩小溶液的量。此步骤可以用于悬浮细胞。使用2×106转染的细胞(来自6孔板转染),轻轻将细胞离心下来,使用和培养板上润洗细胞相同的方法。轻柔地处理细胞,不能振荡,并以尽可能低的速度离心。

        贮液:
        20mg/ml的X-gal溶解于二甲亚砜(-20℃,贮存于聚丙烯试管中,避光)。
        注意:用玻璃移液管或者聚丙烯吸头来定量二甲亚砜溶液。二甲亚砜能溶解聚苯乙烯。
        50mM铁氰化钾(贮存在4℃)。
        50mM亚铁氰化钾(贮存在4℃)。

        工作液:
        固定液:含有2%甲酰胺,0.05%戊二醛D-PBS(贮存于4℃)

        配制方法如下:
        85ml蒸馏水
        10ml不含钙和镁的10X D-PBS(Cat.No.14200-075)(27mM KCl,11mM KHPO4,1.4mM NaCl,81mM Na2HPO4·7H2O)
        5ml福尔马林(37%甲醛溶液)
        0.2ml戊二醛(25%溶液)

        染液:含有5mM 铁氰化钾,5mM亚铁氰化钾,2mM氯化镁的D-PBS(贮存在4℃)。
        配制方法如下:
        70ml蒸馏水
        10ml 10×D-PBS
        10ml 50mM 亚铁氰化钾
        10ml 50mM 铁氰化钾
        0.2ml 1M 氯化镁
        底物/染液:染液含有1mg/ml X-gal
        以下试剂即配即用:
        20ml染液
        1ml X-gal(20mg/ml)

        步骤:
        1. 用质粒pCMV·SPORT-βgal转染,使其表达24小时以上。
        2. 每孔用2ml含有钙镁的D-PBS(Cat.No.14040-133)洗细胞一次。
        3. 在室温用1ml固定液固定细胞5分钟。
        4. 每孔用2ml D-PBS洗两次。
        5. 每孔加入底物/染液溶液1ml并在室温或者37℃温育2小时至过夜。
        6. 每孔加入2mlD-PBS润洗,在倒置显微镜下观察细胞,并估计蓝色细胞(β-gal-阳性)的比例。
        7. 如要保存培养板,每孔中加入1ml含有10%福尔马林的PBS,室温放置10分钟。用D-PBS润洗后4℃保存在PBS中。

        在转染细胞抽提物中测定β-gal表达

        此实验方法用于测定细胞抽提物中β-gal活性。可以测定从96孔板到100mm培养皿转染所得的活性。此方法可适用于悬浮细胞(参见步骤2注意事项)。

        溶液
        裂解液:0.1% Triton X-100/0.1M Tris-HCl(pH8.0)。
        450ml蒸馏水
        50ml 1M Tris-HCl(pH8.0)
        0.5ml Triton X-100去垢剂
        100×Mg溶液
        0.1M氯化镁
        4.5M 2-巯基乙醇
        4℃保存

        0.1M磷酸钠(pH 7.5)
        41ml 0.2M Na2HPO4
        9ml 0.2M NaH2PO4
        50ml蒸馏水

        4mg/ml ONPG(o-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷)溶于含有2mM 2-巯基乙醇的0.1M磷酸钠(pH 7.5),4℃储存。

        1M 碳酸钠水溶液

        使用GENETICIN®筛选抗生素筛选稳定转染株

        筛选所需的GENETICIN抗生素的量会因细胞类型,培养基和血清成分的不同而不同。另外,如果使用粉末GENETICIN抗生素,则需要计算每批抗生素的剂量,因为效价会波动。或者使用GENETICIN抗生素溶液,其活性会为100%。

        一般使用100到1100μg/ml的GENETICIN抗生素浓度筛选稳定的转染株,使用一半的筛选剂量保持培养的抗性。在转染前,使用您的细胞进行一个剂量-反应分析以确定杀死细胞的最低抗生素浓度。可以使用稍高的浓度筛选稳定的转化子。

        制备储液:50mg/ml
        1. 样品计算:
        标记效价:700μg/mg
        如配制10ml,需要500mg活性药品。因此需要的总的干重为714mg。
        2. 称量714mg GENETICIN抗生素。
        3. 溶于10ml蒸馏水。
        4. 无菌过滤。

        或者,可以使用即时可用的溶液(无菌过滤),全效价为50mg/ml活性抗生素。

        剂量-反应分析:
        1. 制备不含青霉素或链霉素的完全培养基。
        2. 加入0到22μl 50mg/ml的GENETICIN抗生素溶液(终浓度为0至1100μg/ml完全培养基,以100ug/ml梯度增加)。
        3. 使用胰酶消化细胞,稀释到4000细胞/ml。
        4. 在6孔板的每孔中加入100μl细胞悬浮液,每孔中已预先加入2ml含稀释GENETICIN抗生素的培养基。将培养板在湿润的5%CO2中37℃温育。每周使用含GENETICIN抗生素的新鲜培养基更换培养基两次。
        5. 在10到14天,除去培养基,使用含钙离子和镁离子的D-PBS清洗细胞。使用溶于50%甲醇的0.5%亚甲基蓝染色细胞20分钟。
        6. 确定杀死所有细胞的GENETICIN抗生素最低浓度。使用紧邻的稍高的浓度进行筛选。

        转染和筛选:
        1. 使用含编码抗生素抗性基因表达序列的质粒(如pSV2neo)转染细胞。
        2. 转染后第二天,将细胞传代,给细胞分裂的空间(根据细胞生长的速度,一般1:10到1:40可以达到效果)。
        3. 转染后2-3天,开始使用抗生素。将转染的细胞在含抗生素的培养基中培养,抗生素的浓度由剂量-反应分析确定。含抗生素的培养基每周更换两次。
        4. 10到14天后,可以观察到抗性克隆,未转染的对照应该没有细胞生长。可以根据需要固定,染色,传代或克隆抗性细胞。

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