• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        【原创\交流】PCR的一些体会,望大家交流!

        丁香园论坛

        2098

        放到“精华”帖子中,以期能进一步深入讨论。请大家积极发言,谈谈自己的体会

        聚合酶链式反应(polymerase chain reaction ,PCR)是一种利用耐热的DNA聚合酶在体外扩增DNA的方法,为最常用的分子生物学技术之一。

        典型的PCR由(1)高温变性模板;(2)引物与模板退火;(3)引物沿模板延伸三步反应组成一个循环,通过多次循环反应,使目的DNA得以迅速扩增。

        当DNA长度小于2kb时,一般PCR反应都问题不大,均较容易得到希望的条带;
        但当DNA长度较长时,PCR就比较困难了,此时就需对PCR的条件进行优化,以获得期望的条带:

        1. 模板
        个人认为,PCR反应中最重要的部分就是模板,模板的种类、丰度、GC含量等都对PCR有很大的影响:

        1.1 种类
        一般我用过的PCR模板种类包括由细胞直接提取的基因组DNA,及由细胞提取的总RNA经反转录RT-PCR得到的cDNA。

        基因组DNA,由于全部基因组全在其中,比较大,其形成二级结构的可能性就比较大,引物在退火时就比较困难,可以试试用酶切的方法解决:选择1-2种目的片段上没有的酶将基因组切碎,可能有助于打开二级结构。

        用总RNA再RT-PCR获得的cDNA,主要问题就是RNA的降解。RT-PCR时若用oligo-dT做引物,获得的是mRNA,这是真核表达获得片段比较常用的方法(因为真核基因一般含有内含子),此时在这一过程中注意RNA的降解问题就比较重要,一般要将所有试剂、枪头等用DEPC(0.1%)处理,其他还有一些注意事项可参看分子克隆。

        1.2 丰度
        这也是个很重要的影响因素,因为如果目的片段的丰度本身非常低的话,理论上虽也可扩增出来,但实际上由于基因组或cDNA库非常大,引物无论设计的有多好,其扩增出非特异片段的可能性都可能比目的片段还来的大,那得到目的片段就很困难了。此时最好的解决办法就是通过查阅文献,找到该目的片段丰度比较高的细胞来进行PCR,会有较好的效果,尤其是在真核细胞提取RNA反转录cDNA过程中,这个问题尤为重要!

        1.3 GC含量
        这个主要影响DNA内部形成二级结构的问题,一般可能在设计引物时会比较困难,扩增时最好也加入一些增强剂或优化剂。

        2. 引物
        引物设计的一般原则大家可能都很清楚,这里不再赘述。一般只需用一些引物设计软件,如Primer Premier 5.0等,基本就可以将引物设计的比较好了。
        不过个人认为不用迷信这些一般原则或软件,我曾扩增过这样两个片段:一个片断引物设计时评分80多,但是扩增了1个多月没有结果;另一个评分17分,只做了一天就拿到了目的片断。主要原因个人认为还是在模板的丰度上,前一个片断用的不是该片断表达活性较高的细胞,而后一个片断用的是体内表达该片段最主要的细胞之一。

        3. 退火温度与延伸时间
        一般退火温度的选择,本人是根据Primer Premier 5.0推荐的退火温度再低5度左右开始进行。
        一般退火温度越高,特异性上升,但效率下降(本来有的条带可能没了)
        退火温度越低,特异性下降(出现非特异带),但基本能扩增出来的条带就都出现了。
        建议先选用比较低的温度开始,等扩出目的片断后,再适当提高退火温度减少非特异带。

        至于延伸时间一般影响不大,只须注意用的是哪种酶。一般taq 1000-1200bp/分钟,pfu 600-800bp/分钟

        4. 缓冲体系
        一般公司卖的酶都配有buffer,通常情况下该buffer都没有问题了。只需有时候注意在扩增大片段时,一些离子对反应有抑制作用,如钾离子等,此时需做简单调整,如自己配buffer即可。

        5. 酶
        本人最常用的是pfu,taq两种酶。
        其中taq较为便宜,扩增效率比较高,但是没有校正功能,再扩增大片段时可能有错配;
        pfu的校正功能比较好,但扩增效率比taq要低,而且比taq稍贵一点。
        个人认为一般taq都可将片断拿到,而pfu有时稍困难些,而且反应时间较长,因此一般第一次用taq扩增,拿到片断后再改pfu;而且如果做的是表达,一般最后一定用pfu,因为对片断正确性要求较高;而如果只是PCR验证,只需用taq就好了。

        6. 增强剂与优化剂
        如果片断内二级结构比较严重,有时可考虑加入增强剂或优化剂,其中DMSO比较常用,有些公司的增强剂、优化剂也可使用,不过个人认为一般这些的作用只是优化条件,使目的片断更明显、减少非特异条带。如果本身就一点扩不出来的话,用处也不是很大。



        另外,对于大片段,还可以分段clone,将大片段分成1-2k左右的几个片断,中间重叠部分利用合适的酶切位点,再将几个片断拼接。
        不过个人认为除非片段过大,比如大于4-5k,此时一次PCR的错配率可能较高,而且确实比较困难了;否则最好还是一次扩增拿到片段后续工作会少一点。

        个人意见,希望大家讨论,给予指正和帮助!

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序