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PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污 染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生.一、污染原因　　(一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于 密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提 取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶 或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染.　　(二)PCR试剂的污染:主要是由于在P ...

最近在做一批细胞，打算要做PCR，因此引物设计这关逃不过了。beta 2 (TGFB2)、TGF A、VEGFC、VEGI各位同仁，我通过向两个老师请教设计了两套引物，方法如下。待各位同仁哪一种方法比较好。引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。设计原则：引物与模板的序列要紧密互补。引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构。引 ...

PCR产物的电泳检测时间　　一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。假阴性，不出现扩增条带　　PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。　　模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时 ...

从外周血提取DNA是一个经常遇到的问题，当然可以用试剂盒提取，不过代价还是有点大，并且不方便，定试剂总要等上几天，如果血液标本不稀缺资源，不妨用一些简便方法提取。方法一(1)取抗凝血5ml在沉淀中加入15ml PBS，混匀，离心2000r/min10min。(2)将血浆转至新的试管中，-70℃保存。(3)将血细胞转入另一支试管中(10ml或50ml)加入尽可能多的冷的蒸馏水混匀。(4)将其插入冰内5～10min或放入-20℃15 ...

基因表达的检测有几种方法。经典的方法（仍然重要）是根据在细胞或生物体中 所观察到的生物化学或表型的变化来决定某一特定基因是否表达。随着大分子分离技 术的进步使得特异的基因产物或蛋白分子的识别和分离成为可能。随着重组DNA技术 的运用，现在有可能检测．分析任何基因的转录产物。目前有好几种方法广泛应用于 于研究特定RNA分子。这些方法包括原位杂交．NORTHERN凝胶分析．打点或印迹打 点．S－1核酸酶分析和RNA酶保护研究。这里描述 ...

在进行荧光定量PCR实验中，Ct数值非常重要，因为通过对标准物质进行定量PCR实验绘制出标准曲线，进而利用标准曲线法求出未知样本中的起始拷贝数。目前定量PCR仪器采用的是最大二阶导数法和样点拟合法计算Ct数值，其原因为实际工作曲线并没有相应的函数所能准确对应，因而采取以上两种方法。这里我举例说明一下使用样点拟合法计算Ct数值并进一步求算出起始拷贝数的过程。y = 4.416x - 80.128 当y=1.64 时 x=18.52y = 2.368x - ...

需准备的材料及试剂：1、DEPC水处理的EP管（1.5ml，1.0ml），Tip头2、玻璃平皿、镊子180℃烘烤6小时，以祛除RNA酶3、硝酸纤维素膜4、DigRNA labeling kit（sp6/T7）5、经分离纯化的线形模板DNA6、DEPC水处理过的无RNase 的0.2M EDTA，PH=8.07、RNA稀释用Buffer8、BufferⅠ9、BufferⅡ10、50×blocking11、Detection12、Dig 抗体及显色底物 ...

真郁闷啊，一个目的基因扩增了3个月也没出来，换了好几个引物，都是文献上的，结果不是产物bp数不对，就是目的条带超暗还有非特。一咬牙，决定赶鸭子上架自己设计一把，结果用primer premier 5.0设计出来的引物，一个90分以上的都没有，也没有错配、发夹等全“NONE”的结果出现，拿分值最高的去OLIGO验证，实在很不理想。当然我知道不可全信软件，但是总得找个让自己信服的根据吧。唉，老板天天对我叹气，说你什么时候能给我个 ...

我用primer premier设计的引物,但是好像有错配.1ctctccaaga agactcagcc agacccactc cagctccgac cctaggagac cgacctcctc61 cagacggcag cagccccagc ccagtggaca accccaggag ccaccacctg gagcgtccgg121 acaccaacct ccgccccgag accgagtcca ggctccggcc gcgcccctcg tcgcctctgc181 ac ...

我刚接触引物设计，希望大家热心帮忙。我从ncbi中找到一些微卫星序列，用pp5.0设计引物，好像根据引物设计原则，都找不到好的引物。不知道是不是在参数的设计上有什么规定，还是有什么窍门。请高手指教。提供几段序列，请高手作为例子帮忙讲解一下如何设计引物扩增重复序列。1 ggtggtggtg ctgtgagtta tacaagaccc agtaggaagc agcggcaggc agtattattt61 cagtggtttg agccaaaact ...

我做的是人巨细胞病毒gB基因，序列如下ccgcggccgtctcgggtgtcttcagggagccgcaccgaccttggctgccaagtccgtatccctcctcctcgactgcgggtgtttcccggagggtccgcgcgacacgcaagagaccacgacgcgcctcatcgctgctggatttggcccgcgacgaacatggaatccaggatctggtgcctgg ...

我设计了一对引物，用几个不同的软件检测，评价不一，能否有谁帮我检查一下？我的序列为：gcccgtacac accgtgtgct gggacacccc acagtcagcc gcatggctcc cctgtgcccc61 agcccctggc tccctctgtt gatcccggcc cctgctccag gcctcactgt gcaactgctg121 ctgtcactgc tgcttctgat gcctgtccat ccccagaggt tgccccggat gc ...

我在ncbi的gene中找我要的基因cDNA，没有找到大鼠的基因，请问我可否用小鼠的基因或人类的基因来代替，如果代替的话，会出现什么问题？我把该基因的CDs序列放上来，能否帮我看看引物设计成什么比较好。atggaac tgaaaatctg acgacatctc tcattaataa601 cacgtgtcat gacacaattg atgaattccg aaatcaagta tactccacta tgtattctgt661 gatctctgtt ...

我做半定量RT-PCR分析,不知道用哪个数据？软件是Quantity One结果：Gel name : 505 2005-04-14 11hr 31min (Raw 1-D Image)IndexNameVolumeAdj. Vol.% Adj. Vol.ConcentrationDensityINundefinedmm2INundefinedmm2INT/mm21U13315.0229129164 990.4582083559 6.1992842653N/A1284.83848788572U24154. ...

第一部分是PCRAbbreviations ixPreface xiChapter 1 An Introduction to PCR 11.1 Introduction: PCR, a ‘DNA photocopier’ 11.2 PCR involves DNA synthesis 11.3 PCR is controlled by heating and cooling 31.4 PCR applications and gene cloning 51.5 History of PCR 6Chapter 2 Understanding PCR 92.1 How does P ...

ttattttcag tgatagtttc里是从网上钓出的一个基因的全长，我的两对能否用？第一对Forward:ATG TAT TTT CAG AGT GGC ACT GInverse:CTA TCA CTG GCG GAC CCC TAA第二对：上游TATGGCCACAAAACTTCAAT下游 ctatcactggcggaccc请问这两对引物可以用吗？谢谢！

我是新手，对设计引物还不太熟悉，下游CG含量高，没办法下手，麻烦大家帮我看一下部分DNA序列如下：1 actgaacttc acagggcaag gggagcccga ctccattcgc tgtgacacac gagcggagct61 gctgtcaaag ggctgcccag ctgatgacat catggaaccc aagagcctcg ctgagacccg121 ggacagccag gcgggcagtc ggaagcagct gtccccacag gaag ...

以下是primer3自动得到的引物，请高手指导，在线等。大写字母为外显子，小写的为内含子。谢谢！！！！OLIGO start len tm gc% any 3' seqLEFT PRIMER 501 20 61.99 55.00 6.00 2.00 AGCCTGGCCAACGTGTCTATRIGHT PRIMER 1026 22 59.42 36.36 2.00 0.00 tcgttgctgtttttctgttttcSEQUENCE SIZE: 1250INCLUDED REGION SIZE: 1250PRODUCT SIZE: 52 ...

我做大鼠肝组织TNFalpha受体的表达，用退火温度52，40个循环都做不出，为什么？它的表达量应该很丰富的呀，会不会RNA降解了，但内参跑出来了（240bp），是不是我从文献上查的引物有问题，请高手帮验证一下；TNFR1 NM_0130911 ttttctccga gttttctgaa ctctggctca tgatcgggct tactggatac gagaatcctg61 gaggaccgta ccctgatttc catctacctc tgac ...

刚刚看到的文章，喜欢的话多多支持啊，请斑竹加分啊。LEAF PCR PROTOCOL(Klimyuk et al., 1993, TPJ 3: 493-494)1) Samples are harvested in 1.5 ml tubes and stored on ice.2) 40ul of 0.25N NaOH was added and the samples boiled for 30 sec.3) 40ul of 0.25N HCl then 20ul Tris mix was added and the samples boiled for another 2 min.-tissue samples can ...