PCR 引物设计及软件使用技巧张新宇，朱有康，高燕宁（中国协和医科大学中国医学科学院肿瘤研究所，北京100021）摘要：本文旨在介绍使用软件设计PCR 引物的技巧。在PCR 引物设计原则的基础上，详细介绍了两种常用引物设计软件的基本使用方法，并对其各自的优缺点进行了比较。一般性引物自动搜索可采用“Premier Primer 5”软件，而引物的评价分析则可采用“Oligo 6”软件。关键词：PCR；引物设计中图分类号：Q524 文献标识码： 文章编 ...
1．材料和方法Access RT-PCR System 试剂盒 (A1250)：Promega 公司产品。500u AMV Rev 目的基因 se Transcriptase, 5u/ul500u Tfl DNA Polym 目的基因 ase, 5u/ul1 ml AMV/Tfl 5×Reaction Buff 目的基因1.25 ml MgSO4, 25 mM100ul dNTP Mixture, 10 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP50ul Positive Control RNA with Carri 目的基因 (1.25 attomole/ul ...
2009年就这样过去了，2009年的下半年我一直在跟RNA提取、逆转录和SYBR GREEN realtime-PCR反应做斗争，现在已经告别当初的迷茫，当别人问自己的时候，也能说出个一二五来了，很高兴。当时在我艰难摸索的时候就想，等我都学会了，我一定要写篇帖子，把一个初学者最初的想法和觉得矛盾、困难、不知如何入手的方法、难点和最后解决的办法写出来，一来可以帮助更多像我这样的人，二来也算让自己有点成就感了，三就是希望版主 ...
最近因为发现一个gene在多种肿瘤中被silenced, 我也在做DNA甲基化. 这里把我折腾1个月的经验和大家分享:)1. Genomic DNA extraction这一步其实也很重要,尤其是对tissue来说. 大家知道DNA hypermethylation会导致chromatin结构紧密, 所以这一步尽量去除DNA结合的蛋白很重要. 我们实验室常用Qiagen的两个kits效果都不是太好,最后还是用proteinase K处理后酚提醇沉 ...
REAL TIME PCR一 ：引物的设计引物的设计对于这个实验至关重要，因为 real time pcr 的检测灵敏度比较高，所以相应的对引物设计的要求就很高。普通的要求规则大家都知道，还有几点必须注意：1，引物的错配率（引物错配形成引物二聚体，但是 SYBR 照样能嵌入进去，结果导致实验结果的误差很大，重复性也不好）。2，引物的特异性一定要高（不像常规 PCR，引物同源性不高，只要两条产物的片段长度相差足够大，在电泳的时候能够区分开就可以。real ti ...
DNA纯度的判断根据OD260/OD280的比值判断，符合要求纯度高的纯化DNA其OD260/OD280在1.6-1.8之间，低于此范围表明蛋白质含量超标，高于此范围表明样品中含有RNA。一般机器给出的比值是分子分母同时减OD320所得,你可以自己算一下OD260/OD280,如果在要求的范围内,说明你的OD320偏高,即可能有有机物污染,比如酒精未充分挥发我要纠正一下，纯DNA的A260/A280应大于1.8，纯 ...
对一些DNA提取方法的总结细菌DNA的提取：（一）试剂：1. 抽提缓冲液2% CTAB (W/V)2% PVP K25 (w/v) （去色素）100mM Tris-HCl (pH8.0)25mM EDTA (pH8.0)2.0M NaCl2.10M LiCl3. 2M LiCl4.DEPC-water（抑制RNA酶活性）5. 3M NaAc (pH5.2)6. 96% 乙醇7. 70% 乙醇步骤：1.抽提缓冲液65℃预热；2. 加菌体到已经预热的缓冲液（700ul）中混匀，65℃，10min；3. 加酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），振荡 ...
正在着手做real-time PCR的朋友们，我想最开始肯定要考虑引物设计的问题。看完下面的文字，我保证你得到想要的引物设计方法和引物序列。第一步：拿到你所要研究的基因的序列。不要告诉我你不会找序列。如果真的不会，请参考丁香园内其他版块，如NCBI使用，序列查找等。第二步：确定你想用哪种方法。Taqman Probe还是SYBR染料？两种方法各有利弊，这里不赘述，不明白的依然参见其他版块。但需要指出的是，后者在国内更常用，因 ...
qPCR的数据相对定量分析其实很简单。我做了很多的qPCR实验，也看了很多的资料，包括Nature protocol， AB官方的分析教程，MIQE，甚至包括一些商业化软件使用的教程及教程里面记述的原理。我在这里跟大家分享一下自己的经验，最常用，最普遍的相对定量方法就是2^-△△Ct法，该法最最简单的说就是：首先将一次实验的所有基因Ct值整理好，之后用每一组样本自身的目的基因Ct值减去自身内参基因Ct值，得到的数就是△Ct ...
Cloning of Long Genehttp://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=344365&sty=1&tpg=45&age=0长片段PCR的new protocolhttp://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=350181&sty=1&tpg=43&age=0Pfu DNA polymerase的延伸时间http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67& ...
TaqMan PCR以及ABI-7700的简单介绍------------------------------------------------ABI PRISM® 7700 Sequence Detection SystemIntegrates a PCR-based assay with laser scanning technology to excite fluorescent dyes present in the specially designed TaqMan® probes. It is a fully integrated system for real ...
先谈引物设计原则，再讲实施方法。引物设计不仅对引物有要求，也对PCR target有要求。Design guidelines for primers:Primers:1 length18-242GC content35%-65%(ideally 40-60%)3Tm60-70°C (ideally 65°C), so that annealing temperature is 58-62°CΔTm (forward primer and reverse primer)
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=155886&sty=1&tpg=63&age=0很小的一个软件，也许会有用。可以预测PCR结果，模拟产物电泳效果。序列同源性的分析：http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=203297&sty=1&tpg=59&age=0序列分析和多序列比较BLAST Web sitehttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ...
昨天找出了这篇关于Real-time PCR数据统计的文章，被引用了1000多次Livak, K. J. and Schmittgen, T. D. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2−ΔΔCT Method Methods. 25, 402, 2001.Abstract:The two most commonly used methods to analyze data from real-time, quantitat ...
PCR enhancer· DMSO and glycerolRecommended by a number of authors to improve amplificationefficiency and specificity of PCR. However, in the multiplex reactionthese enhancers gave conflicting results. For example, 5% DMSOimproved the amplification of some products , decreased ...
这是我目前见到的关于real time的最全诠释的书籍。也很新，是2006年的。我基本上已经读完，获益匪浅。目前自己的试验涉及这个方面。希望与大家多交流。我在园子里搜到有人发了这篇文章的网址，不过还是有不少朋友打不开。我把它的pdf放在163邮箱里了，用户名：dxy1_2009@163.com密码：dxy123456。需要的朋友直接下载就行。能不能给加分也不重要，重要的是对大家有用。不过要是能有一分的奖励，那就更高兴了 呵呵 ...
EB是否致癌http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=314272&sty=1&tpg=48&age=0EB浓度的讨论http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=755857&sty=1&tpg=11&age=0http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=718917&sty=1&tpg=1&age=0http://www.dxy.cn ...
如果大家在用TaqMan做SNP genotyping，应该知道试剂有多贵。有兴趣可以看看这篇文章，一种新的SNP genotyping方法。简单而实用。Biotechniques. 2005 Dec;39(6):885-93. Related Articles, LinksHigh-throughput SNP genotyping by single-tube PCR with Tm-shift primers.Wang J, Chuang K, Ahluwalia M, Patel S, Umblas N, M ...
touchdown PCR即降落PCR，可以选定一个温度范围，如50——35，每个温度2循环，然后在50度15循环。其原理是，随着退火温度的降低，特异性逐步降低，但特异性条带在温度较高时已经扩增出来，其浓度远远超过非特异性条带，随着退火温度的降低，特异性条带优先被扩增。这种方法的退火温度范围较大，在不知道最佳退火温度时比较适用。http://www.espanol.pcrlinks.com/variantes/touchdo ...
多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术发明至今已近20年了，在这期间技术得到了不断的发展，近年来出现的实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR）技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具，本文就此技术及其应用做一综述。1 实时荧光定量PCR技术的方法学1.1 原理 所谓real ...
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