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        DNA的提取 掌握这些就够了

        丁香园论坛

        9595

        今天师兄从丁香园论坛里扒拉出来一些干货,对一些细菌、真菌 DNA 提取方法,做了总结,现在分享给大家:

        细菌 DNA 的提取:

        方法一:

        试剂:

        1. 抽提缓冲液

        2% CTAB (W/V)、2% PVP K25 (w/v)(去色素)、100 mM Tris-HCl (pH8.0)、25 mM EDTA (pH8.0)、2.0M NaCl

        2.10M LiCl

        3. 2M LiCl

        4.DEPC-water(抑制 RNA 酶活性)

        5. 3M NaAc (pH5.2)

        6. 96% 乙醇

        7. 70% 乙醇

        步骤:

        1. 抽提缓冲液 65℃ 预热;

        2. 加菌体到已经预热的缓冲液(700ul)中混匀,65℃,10 min;

        3. 加酚/氯仿/异戊醇(25:24:1),振荡,离心 12,000rpm,10 min;

        4. 取上清,加氯仿/异戊醇(24:1)振荡,离心 12,000rpm,10 min;

        5. 取上清,重复 4 步骤;

        6. 加入 1/10 体积的 3M 醋酸钠和 1.5 倍体积的乙醇(或加入等体积的异丙醇),-20C 沉淀;

        11. 离心 12,000rpm,10 min;

        12. 弃上清,70% 乙醇洗,也可以再用 100% 乙醇洗,然后溶解于 100 ml 水中。

        方法二:

        注意:我们常用的方法,但是有时有些细菌特别不好提,就用上面的方法。

        1. 将菌株接种于液体 LB 培养基,37℃ 震荡培养过夜。

        2. 取 1.5 ml 培养物 12000rpm 离心 2 min。

        3. 沉淀物加入 567 ul 的 TE 缓冲液,反复吹打使之重新悬浮,加入 30ul 10%SDS 和 15ul 的蛋白酶 K,混匀,于 37℃ 温育 1 h.

        4. 加入 100ul 5mol/L NaCl, 充分混匀,再加入 80ul CTAB/NaCl 溶液,混匀后再 65℃ 温育 10 min。

        5. 加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀,离心 4-5 min, 将上清转入一只新管中,加入 0.6-0.8 倍体积的异丙醇,轻轻混合直到 DNA 沉淀下来,沉淀可稍加离心。

        6. 沉淀用 1 ml 的 70% 乙醇洗涤后,离心弃乙醇.

        真菌 DNA 的提取:

        方法一:

        1. 取真菌菌丝 0.5 g, 在液氮中迅速研磨成粉

        2. 加入 4 mL 提取液,快速振荡混匀

        3. 加入等体积的 4 mL 的氯仿: 异戊醇 (24:1),涡旋 3~5 min(此处是粗提没有加酚,可以节约成本的哟!)

        4.1000rpm,4℃,5 min

        5. 上清用体积的氯仿: 异戊醇 (24:1) 再抽提一次(10,000 rpm,4℃ 离心 5 min)

        6. 取上清,加入 2/3 倍体积的-20℃ 预冷异丙醇或 2.5 倍体积的无水乙醇沉淀, 混匀, 静置约 30 min

        7. 用毛细玻棒挑出絮状沉淀, 用 75% 乙醇反复漂洗数次, 再用无水乙醇漂洗 1 次, 吹干,重悬于 500 mulTE 中

        8. 加入 1 ul RNaseA(10 mg/mL),37℃ 处理 1 hr

        9. 用酚(pH8.0): 氯仿: 异戊醇 (25:24:1) 和氯仿: 异戊醇 (24:1) 各抽提 1 次(10,000 rpm,4℃ 离心 5 min)

        10. 取上清,1/10V 3M NaAc,2.5V 体积的无水乙醇, -70℃ 沉淀 30 min 以上

        11. 沉淀用 75% 乙醇漂洗,风干, 溶于 200 ulTE 中,-20 ℃ 保存备用

        12. DNA 提取液:0.2M Tris-HCl(pH 7.5),0.5M NaCl,0.01M EDTA,1%SDS,

        3M NaAc

        方法二:

        1. 真菌菌丝 0.5-1 g, 在液氮中迅速研磨成粉

        2. 加入 3 mL 65℃ 预热的 DNA 提取缓冲液,快速振荡混匀 65℃ 水浴 30 min, 期间混匀 2-3 次

        3.加入 1 mL 5M KAc,冰浴 20 min

        4.等体积的氯仿: 异戊醇 (24:1) 抽提 1 次(10,000 rpm,4℃ 离心 5 min)

        5.取上清,加入 2/3 倍体积的-20℃ 预冷异丙醇, 混匀, 静置约 30 min

        6.用毛细玻棒挑出絮状沉淀, 用 75% 乙醇反复漂洗数次, 再用无水乙醇漂洗 1 次, 吹干,重悬于 500 mL TE 中

        7.加入 1 ul RNaseA(10 mg/mL),37℃ 处理 1 hr

        8.用酚(pH8.0): 氯仿: 异戊醇 (25:24:1) 和氯仿: 异戊醇 (24:1) 各抽提 1 次(10,000 rpm,4℃ 离心 5 min)

        9.取上清,1/10V 3M NaAc,2.5V 体积的无水乙醇, -70℃ 沉淀 30 min 以上

        10.沉淀用 75% 乙醇漂洗,风干, 溶于 200 ul TE 中,-20 ℃ 保存备用。

        以上就是一些实验室常用的方法.

        想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你,都可以成为师兄的好伙伴。

        师兄微信号:shixiongcoming

        DNA的提取 掌握这些就够了

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