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        细胞内示踪研究

        相关实验:用于基因传递的蛋白质纳米球:明胶纳米颗粒的制备和体外转染实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        细胞内示踪研究

        材料

        试剂

        待金纳米颗粒处理的细胞

        蒸馏去离子水 (d d H 20)

        乙 醇(200 proof) ( 3 0 % 、5 0 % 、7 5 % 、8 5 % 、% % _1_0_0_~7_~B~K~Hp~M~2~1~0~Kp~M~2~1~0~0明 胶(B 型,B l o o m strength 225)

        戊二醛 (2. 5 % ,溶 于 0. lmol/L 甲次砷酸钠缓冲溶液)

        甘 氨 酸(0. lmol/L )

        醛 ( 4 0 % 戊二醛)

        氯化金 (4.34% m /V )

        培养基: 细胞生长培养基和无血清培养基

        四氧化锇 (1% 溶 于 0. lmol/L 甲次砷酸钠缓冲溶液)

        甲次砷酸钠缓冲溶液 (〇. lmol/L )

        氢氧化钠 (〇.lmol/L )

        S purr 树脂

        柠檬酸钠 (1% m /V ,新鲜配制)

        仪器

        Aclar 板

        铝片

        37°C 细胞培养箱

        冷冻干燥机

        6 〇°C 烘箱

        回流冷凝管

        250m l 圆底烧瓶

        6 孔组织培养板

        透射电子显微镜

        超速离心机

        超薄切片机

        37°C 水浴

        方法

        金纳米颗粒的制备

        1.在连接回流冷凝装置的 250m l 圆底烧瓶中加人 99 ml d d H 20 。

        2.加 入 230)lJ 4. 34%(»27 V ) 氣化金溶液,揽伴,加热到回流。

        3.加人大约 2.-5m l 新鲜配制的 l% ( m /V ) 柠檬酸钠溶液。

        4.加 热 IO m in,溶液的颜色由灰色变为黑紫色,葡萄酒色,最后深红色。

        5.继续加热 2〜3m i n , 直到瑢液呈稳定的橘红色。

        6 . 冷却反应液至室温,4°C 保存。

        7.32 000r / m i n 离心分离金纳米颗粒。颗粒的粒径范围为 1 0 〜 1 5 n m 。

        蛋白质纳米球包裹金纳米颗粒

        8•将 200m g 明胶溶解在 20m l 水中,配 制 l% 〇 n /V ) 明胶溶液,在 37℃水浴下溶解。

        9•将上述制备的金纳米颗粒和明胶溶液在 37°C 下混合。

        10.用 O.l m o l / L N a O H 调节溶液 p H 至 7.0。接着,然后按方案 1 步骤 3〜5 制备明胶纳米颗粒。为了制备包裹金纳米颗粒的明胶颗粒,按方 案 1 描述的方法将它们分散在明胶溶液中。

        11•离心分离包裹金的明胶纳米颗粒,按方案 1 步骤 6〜8 冻干。
        细胞培养

        1 2 •把 A d a r 板剪成方形,尺寸和 6 孔板匹配。
        减去其中一个小角, 用于区分细胞生长面 (图 3)。

        13.加人合适的培养基,在 A c l a r 板种植细胞, 37° C 培养到 5 0% 的细胞密度。细胞接种密度可以为 I X l O 5 个每孔; 根据细胞生长的快慢,培 养 24〜48 h 。

        14.将包裹金纳米颗粒的明胶纳米粒重悬于无血清的培养基,37°C 和细胞一起培养。

        为了确定细胞对纳米颗粒的吞噬时间, 可调节培养时间为 1〜6 h , 不同时间点取样, 用电镜观测。

        15•除去纳米颗粒悬浮液,加入培养基。

        16.分时间点制样,按照下面操作制备电镜样品。

        电镜样品的制备

        17•取出样品浸入 2 ml 2. 5 % ( m A 〇的戊二醛中 I h(戊二醛溶于 0.lmol/L 甲次砷酸钠缓冲溶液)。

        18.用 0 • lmol/L 甲次砷酸钠缓冲溶液 4 °C 下清洗样品 3 次 ,每 次 lO m in 。

        19•用 1%(m/v)四氧化锇 (溶于 O.lm 〇 l/L 二甲砷酸盐缓冲溶液) 室温下固定细胞 l h ,然后用 0 • lmol/L 甲次砷酸钠缓冲溶液清洗 3 次 ,每 次 lOmin。

        20.用不同浓度的乙醇依次浸泡细胞,进行脱水处理,乙醇浓度依次为 30%、5 0 % 、7 5 % 、8 5 % 和 95%, 每次浸泡 l O min。

        2 1 •室温下用 1 0 0 % 乙醇脱水处理 lh。

        22.用 I : 1 乙醇和 S p u r r 树脂浸润细胞 I.5 h , 接着用 100% Spurr 树脂包埋 2 h

        23.将带有脱水和树脂包埋细胞的 A c l a r 板置于覆盖 S p u r r 树脂的铝片的底部,60°C 烘箱中加热聚合 24 h 。

        2 4•超薄切片 S p u r r 树脂中的样品。
        25.用四氧化锇对 切 片 染色,电镜下观测。 T E M 样品制备的步骤总结于表1。 表 I .TEM 样品制备总结

        来源:丁香实验

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