技术原理与方法｜渐变对比度方法简介

仪景通2025-08-11

1. 相衬方法的变化

图 1 通过相应的光学元件排列简要说明了无需染色即可观察透明物体的常见相位可视化方法。传统的相位可视化方法通过在聚光镜光瞳和物镜光瞳中分别放置特定光学元件来实现。

图 1. 各种相位可视化方法的光路布置。

各种相位可视化方法的必要光学元件。a. 相衬方法；b. 微分干涉方法；c. 调制对比方法；d. 渐变对比方法。

相衬方法（图 1a）组合使用带环状孔径的专用聚光器透镜和含有相位膜环的专用物镜透镜。在通过聚光镜环状孔径的光线中，那些直接通过样品的光线会通过物镜光瞳的相位膜。另一方面，被样品偏转的光线在相位膜外通过，从而在两个分量相互干扰的点产生明暗对比。这一过程的典型特征是，在样品的折射率分布发生变化的台阶处会出现光晕现象。厚样品不适合采用这种方法，因为会出现过强的光晕。

微分干涉方法（图 1b）是一种偏振剪切干涉仪，在聚光镜光瞳和物镜光瞳位置装有互补的沃拉斯顿棱镜。样品图像变为在固定方向上略微偏移的重像，并且样品的折射率梯度带有阴影，使其看起来具有三维立体感。由于采用了偏光干涉，如果有塑料皮氏培养皿或其它物体在光路中造成偏振失真，则无法进行观察。

调制对比方法（图 1c）利用聚光镜光瞳的狭缝开口将照明光束限制在一个方向。引导光束会使样品中光的直线部分呈现灰色，而由于物镜光瞳的调制器，折射部分的对比度将根据折射方向而变化。通过透射或屏蔽部分光，可以获得类似于微分干涉图像的三维图像。由于调制对比方法中不使用偏光，可以使用皮氏培养皿之类的塑料容器。但使用这种方法时分辨率略有下降，因为限制照明光束的方向意味着照明数值孔径（NA）较小。

2. 渐变对比方法

渐变对比方法（图 1d）的特点是生成一个类似于微分干涉方法图像的伪三维图像。其他相位可视化方法需要使用多个光学元件在未染色样品中产生对比，而渐变对比只需在物镜光瞳中插入一个渐变 ND 滤光片即可实现。

（1）渐变对比方法的原理

插入到物镜光瞳位置的渐变 ND 滤光片在一个方向上的透射率单调递减。与物镜光瞳直径相比，投射在物镜光瞳位置的聚光镜透镜的孔径直径有所减少。如果样品的折射率分布平坦，聚光镜透镜的孔径图像会投射在物镜光瞳的中心位置，并随后受到渐变 ND 滤光片中心附近透射率的影响（图 2a）。当样品的折射率分布发生倾斜时，聚光镜透镜的孔径图像会从渐变 ND 滤光片的中心偏移，因此当光束在样品位置发生折射时，渐变 ND 滤光片的整体透射率会发生变化（图 2b 和 c）。因此，它的成像亮度与样品折射率的倾斜度相对应，并且样品的折射率分布呈现三维立体状（图 2d）。

聚光镜透镜的孔径可以用孔径光阑进行调整。如果它相对较大，则由于样品的折射率倾斜而引起的亮度变化可能不足。因此，使用图像传感器捕获的图像会被强调并以易于查看的对比度显示。

图 2. 渐变对比方法原理的示意图

用渐变对比方法说明相位物体的明暗对比原理。a. 如果样品的相位分布平坦，光束会直射并笔直地通过渐变 ND 滤光片的中心附近。b、c. 如果样品的相位分布倾斜，则光线会发生折射，使倾斜方向通过渐变 ND 滤光片 (b) 的较亮部分或 (c) 较暗部分。d. 观测图像的明暗对比取决于样品相位分布的倾斜方向。

（2）渐变对比方法的特性

渐变对比方法产生的相位图像具有以传统相位可视化方法产生的图像所不具备的许多优点。可对厚样品采用渐变对比方法，因为与相衬方法不同，该方法不会产生光晕。与微分干涉方法不同的是，渐变对比方法不基于偏振，因此即使透过塑料容器，也可以很好地生成样品的伪三维图像。此外，由于其照明的数值孔径大于其他方法，因此不易出现因透过有水滴的皮氏培养皿盖成像而产生的问题。该特性还可防止在调制对比方法中采用屏蔽元件而导致的分辨率下降。另一个实用优点是，无需专用物镜，也无需在物镜转换时切换元件，从而可以更快、更方便地进行观察。