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碱性磷酸酶的染色检测

互联网2013-11-13

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实验原理

本试验是一个酶组织化学试验，酶组织化学是在不破坏组织细胞的条件下，检测酶的存在，定位与活性的学科，即在酶的存在，分布及其用在显微镜下变成可见的。生命是有序的，包括时间的有序及其空间的有序。其中美的空间有序性在于其细胞组织结构的精确位置，各种酶的自己的位置保证了化学活动的有效进行。
酶的定位方法必须准确，其显示方法必须具有高度的特异性，使酶本身具有可见性，这是一种直接的方法，目前主要有免疫荧光化学法，该法敏感性高，速度快，但成本高。如果有相同的抗原决定簇时，则会有交叉反应。方法成熟，使用广泛的还是经典的组织化学方法。下面以碱性磷酸酶的显示方法来学习经典酶组织化学的理论及操作。经典酶组织化学不是显示酶本身，常采用的方法是：在一定条件下，使细胞中的酶作用于酶的底物，使其产物在原地进行捕捉、沉淀转化为有色产物。碱性磷酸酶（AKP）的显示方法最早由Gomeri（1939）提出，现在这种方法称为Gomeri法。碱性磷酸酶是指磷酸单酯酶Ⅰ，它能在pH8.6~10.0的最适条件下分解磷酸单酯，对于与磷酸相接的醇基没有特异性，Gomeri法是让该酶在碱性条件下，分解甘油磷酸钠，产生磷酸根。

在孵育液中加入CaCl₂ ，分解产生的磷酸根离子立即被Ca² 原位捕捉形成沉淀。

HPO^2- - Ca² →→CaHPO₄ ↓（无色沉淀）

因出现的是无色沉淀，故还不能在光镜下观察到，尚需转化为有色沉淀，先让制片与Co（NO₃ ）₂ 反应生成磷酸钴：

CaHPO₄ Co（NO₃ ）₂ →→CoHPO₄ ↓（无色沉淀） Ca（NO₃ ）₂

再让它与硫化铵反应生成黑色的硫化钴沉淀。

CoHPO₄ （NH₄ ）2S→→（NH₄ ）₂ HPO₄ CoS ↓（黑色沉淀）
我们可以在显微镜下观察到黑色沉淀的位置，由于以上的这些操作都是在原位进行的，可以认为黑色沉淀的位置就是酶所在的位置，这类方法是让酶作用于底物而将酶显示出来。因此制作酶组织切片的时候不能使酶失活，还要尽量避免酶所需的反应的产物扩散，否则不会得到正确的结果。

实验试剂

1. 二甲苯
2. 无水乙醇

3. 95%乙醇
4. 90%乙醇

5. 70%乙醇
6. 30%乙醇

7. 3% 甘油磷酸钠
8. 2%巴比妥液

9. 2% 氯化钙
10. 2%硫酸镁

11. 2%硫化铵（45ml蒸馏水硫化铵6-7滴）
12. 2%硝酸钴

13. AKP作用液：

3%甘油磷酸钠 10ml

2%巴比妥液 10ml

2%氯化钙 2 ml

2%硫酸镁 1 ml

蒸馏水 20 ml

实验设备

1. 立式染缸 12个

3. 量筒 25ml 1个

4. 恒温水浴（37°C） 1个

5. 沸水浴 1个

实验材料

组织制备
1. 取材：取动物肾、小肠等大块组织，大小约2-3mm
2. 固定：将取下的材料迅速在冷丙酮中固定24小时（一直在4°C中进行），中间换冷丙酮4次
3. 包埋：将固定好的材料，用纯酒精脱水30分钟（中间交换一次），二甲苯透明（20分钟），用快速法把材料包埋于石蜡中（用低熔点的石蜡）
4. 切片：切片5~6µ，在37°C以下的温水中展片，将蜡片粘于涂有蛋白胶的载波片上
5. 把切片置于37°C温箱种干燥小时
6. 将切片置于4°C的冰箱，直至试验前才取出

实验步骤

1. 每人取已粘好烘干的鼠肾切片两块，放入二甲苯（一）→→二甲苯（二）（各3-4分钟）的染缸中进行脱蜡，再经100%乙醇（一）→→100%乙醇（二）→→95%乙醇→→90%乙醇→→70%乙醇→→30%乙醇→→水。每级各一分钟，在移切片时，用镊子夹住切片震荡并提起，放下反复几次，在移入下一染缸边缘前稍停留，让溶液滴净后，再入下一染缸，以免把上一染缸溶液过多带入下一染缸，而影响切片质量；

2. 将其中一块切片以蜡笔作一标记（用作对照组切片），放入沸水中煮沸5分钟；
3. 将两块切片均放入AKP作用液中孵育30-60分钟，作用液要事先预热到37°C，水浴中进行；

4. 取出切片在蒸馏水中洗涤；

5. 放入硝酸钴溶液2-3分钟；

6. 蒸馏水冲洗干净，否则切片易被污染，影响定位；

7. 切片浸入硫化铵中2-3分钟；

8. 蒸馏水冲洗干净；

9. 经各级酒精脱水。即30%乙醇→→70%乙醇→→90%乙醇→→950%乙醇→→100%乙醇（二）→→100%乙醇（一），各级一分钟。

注意事项

观察结果：

在显微镜下观察，细胞中有黑色沉淀存在的地方，就表明有酶的存在。煮沸的对照切片无黑色沉淀。

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