【专题讨论】SPITC法修饰研究

各位大大， 最近小妹接到老板的任务， 要对SPITC法修饰研究进行实验， 在参考了大量的文献（15篇左右）， 总结出了如下的流程， 并且进行了实验，我会把我的实验过程和结果贴出来， 希望大家能够共同分析并且提供小妹建议， 谢谢！！

以下是我试验的一个protocol，希望各位前辈能指点一下，谢谢！
我用BSA（国产）1mg 做样品，大致的流程是：先溶液酶解，然后C18 ZipTip固相SPITC衍生，洗脱冻干后打MALDI。具体步骤如下：
（一）溶液酶解：
8 M Urea 300ul(然后取30ul 进行下面步骤)
0.4% NP40 40ul
50mM NH4HCO3 111.6ul
0.5M DTT (现配) 2.0ul(56℃ 30min)
0.55M IAA(现配) 5.4ul(暗处 50min）
Trypsin(protein:trypsin=20:1) 37 ℃ 17h

17h后（第二天）发现水浴温度只有20℃，然后又37℃水浴了2h。取出后冻干。

（二）SPITC固相衍生
1.将C18 ZipTip缓慢吸入压出50%ACN/0.5%TFA 溶液数次，然后用0.1%TFA平衡
2.用200ul 0.1%TFA 将冻干样品复溶
3.用ZipTip 吸入压出复溶液大约10次左右
4.用0.1%TFA 冲洗
5.先用Tris-HCl Buffer(50mM/L PH 8.2)冲洗ZipTip，然后用ZipTip缓慢吸入2.55mg/ml SPITC (Tris-HCl Buffer配制)，然后50℃ 水浴 1h
6.取出ZipTip，将多余试剂用0.1%TFA 冲洗干净，衍生后的样品用2.5ul 80%ACN/0.5%TFA 洗脱，冻干。

（三）MALDI 分析
1.将冻干的样品用1ul 0.1%TFA 复溶，加入1ul Matrix CCA（50%ACN/0.5%TFA的饱和液），混匀后点在样品板上，自然风干后打MALDI 。