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        Morpholino修饰斑马鱼基因

        相关实验:斑马鱼遗传修饰技术

        别名:吗啉代寡核苷酸,MO

        最新修订时间:

        简介

        Morpholino 修饰斑马鱼基因,是使基因表达沉默,修饰基因的剪接,或者阻止 miRNA 的成熟及活性。Morpholinos 并不降解其靶向 RNA,而是在与靶序列结合后,以一种 RNA 酶依赖的空间位阻效应来发挥作用。

        原理

        Morpholino 修饰斑马鱼基因的基本原理是利用吗琳环(Morpholino,MO)与核糖核苷酸中五元碳环的结构类似性、人工合成针对特异基因的 MO,可以达到抑制其 mRNA 翻译出功能蛋白的效果。Morpholino oligos 可以使基因表达沉默,修饰基因的剪接或者阻止 miRNA 的成熟及活性。Morpholinos 并不降解其靶向 RNA,而是在与靶序列结合后,以一种 RNA 酶非依赖的空间位阻效应来发挥作用。Morpholino修饰斑马鱼基因

        材料与仪器

        器材:

        拉针仪、显微注射器、持针器和显微操纵器、体视显微镜

        试剂:

        Morpholino 样品

        步骤

        Morpholino 修饰斑马鱼基因的基本过程可分为如下几步:

        (一)流程一


        A. 根拟 mRNA 的翻译起始点序列设计一个 MO;

        B. 在体内与这种 mRNA 相结合,进而阻止了核糖体的结合,达到阻止其翻译合成蛋白的目的。

        注意事项:效果通常利用翻译起始位点附近序列和绿色荧光蛋白 GFP 的融合蛋臼与 MO 共同注射来检验。

        (二)流程二


        A. 根据前体 RNA 来设计 MO;

        选择的序列位于内含子与外显子的交接处,这样设计的 MO 则可以通过结合到内含子-外显子交接处阻止剪接复合体的结合,进而产生非正常的成熟 mRNA。

        注意事项

        效果通常用反转录 PCR 观测是否出现正常长度的产物来检验。

        常见问题

        常见问题 1

        问题表现:MO 的效果

        可能原因:由于体内的 P53 信号的激活等原因,所有的 MO 都会多多少少对胚胎的发育造成一定的影响,比如发育迟缓等,所以比较注射了 MO 的胚胎和对照组胚胎的时候,应当在同一发育程度来比较,而不是以同样的生长时间为参照。

        解决方案:一般可以针对同一靶基因同时合成两三条不同的 MO, 然后检验其对胚胎发育的影响是否一致

        常见问题 2

        问题表现:MO 的特异性

        解决方案:一般会采用 Rescue 的方法。通常的做法是体外转录合成靶基因的 mRNA、与其 MO 共同显微注射,视其能否恢复或部分恢复到注射之前的生物学效应。

        来源:丁香实验

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