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        用流式测细胞周期的一点总结

        互联网

        5732

        【细胞种类】小牛肺动脉平滑肌细胞第5代;
        【培养液】含15%FBS的MEM液;
        【固定方法】70%酒精固定;
        【染色方法】PI单染法;
        【具体步骤】
        1、接种: 以1undefined5/ml密度(活细胞)接种,加培养液;
        2、同步化: 24h后加不含FBS的MEM进行同步化12-24h;
        3、加因素: 弃MEM液换等量的培养液,加药物等因素培养到指定时间;
        4、消化: 用不含EDTA的0.25%胰酶进行消化,离心(2000转5min);
        5、洗涤: 用PBS液洗一边,弃上液;
        6、固定: 向10ml试管内加2.5ml盐水G溶液(配置方法见司徒镇强《细胞培养》)重新悬浮细胞,然后缓慢加入-20度预冷的95%酒精7.5ml,冰浴30min;(可以过夜,第二天染色)
        7、PI单染法: 吹散细胞后用300目尼龙滤膜过滤,然后离心,去上液;加100ul 5mg/ml RNA酶溶液,37度保温30min,然后冰浴终止酶作用;加PI染液(100ug/ml)闭光染色30min;
        8、FCM测细胞周期。

        【注意点】
        1、同步化是为了各单个细胞处于相对的同一周期内,即“饥饿疗法”,目前虽有争议,但这一步是不可或缺的。
        2、对于PI单染还是双染好,目前也是意见不一,本实验采用单染法。
        3、300目尼龙滤膜过滤是为了减少聚在一起的细胞团,防治堵塞流式仪。

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