用流式测细胞周期的一点总结
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【细胞种类】小牛肺动脉平滑肌细胞第5代；
【培养液】含15％FBS的MEM液；
【固定方法】70％酒精固定；
【染色方法】PI单染法；
【具体步骤】
1. 接种： 以1undefined5/ml密度（活细胞）接种，加培养液；
2. 同步化： 24 h后加不含FBS的MEM进行同步化12－24 h；
3. 加因素： 弃MEM液换等量的培养液，加药物等因素培养到指定时间；
4. 消化： 用不含EDTA的0.25％胰酶进行消化，离心（2000转5 min）；
5. 洗涤： 用PBS液洗一边，弃上液；
6. 固定： 向10 ml试管内加2.5 ml盐水G溶液（配置方法见司徒镇强《细胞培养》）重新悬浮细胞，然后缓慢加入－20度预冷的95％酒精7.5 ml，冰浴30 min；（可以过夜，第二天染色）
7. PI单染法： 吹散细胞后用300目尼龙滤膜过滤，然后离心，去上液；加100 ul 5 mg/ml RNA酶溶液，37度保温30 min，然后冰浴终止酶作用；加PI染液（100 ug/ml）闭光染色30 min；
8. FCM测细胞周期。
【注意点】
1. 同步化是为了各单个细胞处于相对的同一周期内，即“饥饿疗法”，目前虽有争议，但这一步是不可或缺的。
2. 对于PI单染还是双染好，目前也是意见不一，本实验采用单染法。
3. 300目尼龙滤膜过滤是为了减少聚在一起的细胞团，防治堵塞流式仪。
