小鼠视网膜铺片及免疫荧光染色

       在研究血管性视网膜疾病时，由于小鼠眼球较小，不便于进行眼底血管的直接观察。病理切片染色是诊断及评判的金标准，但该方法只能观察切面形态。视网膜铺片是研究血管性视网膜疾病的常用方法。

下面介绍详细操作流程：

第一步：心脏灌流固定

小鼠麻醉后，仰卧位固定小鼠四肢, 剪开胸腔，充分暴露心脏，在心尖左旁2 mm处用输液针头刺入并剪开右心耳, 迅速灌注生理盐水100mL, 肝肠变白表明灌注成功, 旋转输液开关, 再灌入多聚甲醛溶液100 mL, 小鼠四肢抽动表明灌注固定液成功, 待抽动完全停止、全身组织器官变硬后摘取眼球，再用甲醛固定25 min。

第二步：视网膜铺片

    取出眼球置于载玻片上，用吸管滴一大滴生理盐水于眼球上保证眼球完全浸没于水滴中

    眼科显微镊（带齿）夹住总腱环，用显微剪沿总腱环将角膜剪下，暴露并挤出晶状体（椭球状）；除去角膜、虹膜、晶状体。


    用齿镊夹住视神经，无齿镊将视网膜挤出，展开呈碗状，滴一滴生理盐水在上面，以视盘为中心, 放射状切开4刀, 呈四叶草状，去除色素颗粒, 神经层向上展平,加数滴PBS, 轻轻漂洗干净。
第三步：免疫荧光染色
    视网膜置于3 g· L^-1TritonX-100中4 ℃孵育1 h；从TritonX-100中取出后滴加山羊血清室温封闭抗原2 h, 吸去封闭液, 不洗。水浴箱孵育a-SMA单克隆抗体(1:100, 1 g· L^-1TritonX-100稀释)37 ℃，3 h。滴少许抗荧光淬灭剂封片, 于荧光显微镜490 nm波长下观察。

操作要点
    推挤出视网膜后，建议用眼科手术刀将视网膜切开而不推荐剪刀剪，因为眼科剪较厚，容易将视网膜挤压变形，当然熟练的老手可以无视！