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        免疫荧光染色方法

        互联网

        3524
        (一)制片

        选无自发性荧光的石英玻片或普通优质玻片,洗净后浸泡于无水乙醇和乙醚等量混合液中。用时取出用绸布擦净。将待检样品如组织块剪成适当大小印压于玻片上。也可采用冰冻切片或石蜡切片样品。

        (二)固定

         

        除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外,一般均应固定。固定的作用有三: 防止标本从玻片上脱落; 除去防碍抗原—抗体结合的类脂,使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果; 固定的标本易于保存,如组织切片固定后在 -20 下可保存一年而不改变其染色特性。

        标本的固定原则是:①不能损伤细胞内的抗原;②不能凝集蛋白质;③不能损伤细胞形态;④固定后应保持细胞膜的通透性,以允许抗体进入与抗原结合。

        常用抗原物质的固定方法

         

         

        抗原物质

         

        固定剂

         

         

        固定条件( min

        蛋白质抗原

         

         

        95% 100% 乙醇

         

         

        室温 3 10

        酶、激素

         

         

         

         

        4 30

        免疫球蛋白

         

         

        四氯化碳

         

         

         

         

         

         

        丙酮、四氯化碳、无水乙醇

         

         

        室温 5 10 4 30 60

        多糖、细菌等

         

         

        微火加热,甲醇、 10% 甲醛、丙酮

         

         

        室温 5 10 4 30~60

        (异嗜性抗原)

         

        10% 甲醛, 10% 佛茂尔( ForMol

         

         

        室温 3 10

        (三)水洗

         

        固定后以冷的 0.01Mol/L pH7.4PBS 液浸泡冲洗,最后以蒸馏水冲洗,防止自发性荧光。

        (四)染色

        染色分直接染色法与间接染色法。

        1. 材料与试剂

        1 )荧光抗体,稀释至应用浓度。

        2 0.01Mol/L pH7.4PBS

        3 9 份优质甘油加 1 pH7.4PBS 液即为甘油缓冲液。甘油有减少非特异性荧光的作用。

        4 )带盖方盘

        2 .直接染色法

        1 )将固定好的玻片置于湿盘中,滴加荧光抗体染色液,以覆盖为度,加盖, 37 ℃感做 30 min 45min

        2 PBS 冲洗 3 次,每次冲洗 3min ,即 3 × 3 ˊ 冲洗。

        3 )蒸馏水冲洗。

        4 )滴甘油缓冲液一滴,封片,荧光显微镜检查。

        2. 间接染色法

        (1) 检查抗原:①取固定标本,加已知的免疫血清, 37 孵育 30min ;②以 PBS 3 × 3 ˊ 冲洗;③再加荧光标记的抗抗体, 37 孵育 30min ;④ PBS 3 × 3 ˊ冲洗;⑤ H2 O 冲洗,凉干;⑥加甘油缓冲液,封片、镜检。

        (2) 检查抗体:①以免疫后动物的淋巴组织涂片,自然干燥,甲醇固定;②滴加相应抗原液(按 1 100 1 500 稀释), 37 孵育 30min ;③ PBS 3 × 3 ˊ冲洗;④ 加荧光抗体, 37 孵育 30min ;⑤ PBS 3 × 3 ˊ冲洗;⑥ 水洗,凉干;⑦加甘油缓冲液,封片、镜检。

         

         

         

        (五)结果显示

         

         

        荧光显微镜所观察到的图象,主要以两个指标判断结果,一个是形态学特征;另一个是荧光的亮度,在结果的判定中,必须将二者结合起来,综合判定。

        荧光强度的表示方法如下:

        +++ ++++:荧光闪亮,呈明显的亮绿色。

        ++ :荧光明亮,呈黄绿色。

        :荧光较弱,但清楚可见。

        ± :极弱的可疑荧光。

        :无荧光。

        (六)标本保存

         

        由于荧光色素和蛋白质分子的稳定性都是相对的,因此随着保存时间的延长,在各种条件影响下,标记蛋白可能变性解离,失去其应有的亮度和特异性。因此给标本的保存带来一定的困难,所以在标本进行荧光染色之后应立即观察。

        保存的方法可采取以下几种:①固定标本片以后低温保存,随用随染;②染色片采取优质封固剂,如特别的荧光封固剂( Fluormount )或碱性优质纯甘油固剂等封固。这些封固剂能防止荧光激发,封固后低温保存;④可以采用拍照保存照片。

         

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