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        Polymerase Chain Reaction (PCR) to Amplify rRNA Gene Fragment

        互联网

        1151

         

        <center> <b><font>Polymerase Chain Reaction (PCR) to Amplify rRNA Gene Fragment</font> </b></center>
        1. Prepare sufficient master mix for both partners (45 mL/50 mL reaction)
          • 10 mL 10x PCR buffer
          • 10 mL 2.5 mM dNTPs (0.25 mM final concentration)
          • 15 mL Primer A (5 pmole/mL)
          • 15 mL Primer B (5 pmole/mL)
          • 40 mL H2 O
          • 0.4 mL TaKaRa Ex-Taq DNA Polymerase (2 units)( Panvera )
          • 90 mL

        2. Aliquot 45 mL of master mix into each of two 0.5 mL microfuge tubes labelled with the student's initials; PCR; date.

        3. Add 1-5 mL template DNA1 (100 ng for bacterial genomic DNA), 0-4 mL H2 O to yield a final volume of 50 mL.

        4. Add 50 mL mineral oil (using cut pipette tip), close tube tightly, place in thermal cycler.

        5. Initiate thermal cycling program.
        PCR55
          Phase 1 - 1 cycle
          • Initial denaturation 4 min. @ 94o C
          • Primer annealing 45 sec. @ 55o C
          • Primer extension2 1 min. @ 72o C
        • Phase 2 - 35 cycles
          • standard denaturation 1 min. @ 94o C
          • Primer annealing 45 sec. @ 55o C
          • Primer extension2 1 min. @ 72o C
        • Phase 3 - 1 cycle
          • standard denaturation 1 min. @ 94o C
          • Primer annealing 45 sec. @ 55o C
          • Primer extension2 10 min. @ 72o C
        Notes:

        1 To improve specificity, template DNA concentration, annealing temperature and Mg2+ concentration may be varied.

        2 1 minute extension time should be used for each kbp of product expected.

         

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