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        辛酸-硫酸铵法从人血清中纯化IgG

        互联网

        9241

        一、实验目的

        1、初步掌握从血清中提取纯化IgG的方法步骤。

        2、了解辛酸-硫酸铵法纯化IgG 的原理。

        二、实验原理

        辛酸-硫酸铵法分两步进行。第一步用辛酸沉淀杂蛋白,辛酸为短链脂肪酸,在酸性条件下可沉淀血清或腹水中的白蛋白或其他非Ig蛋白质;第二步利用硫酸铵盐析将Ig沉淀下来,操作步骤如图3-10所示。经SDS-PAGE电泳检测能得到电泳纯度较高的Ig。

        辛酸-硫酸铵法从人血清中纯化IgG

        三、仪器、原料和试剂

        1、仪器

        磁力搅拌器、离心机、低温冰柜。

        2、原料

        抗血清(兔抗鸡血清)。

        3、试剂

        (1) 乙酸-乙酸钠缓冲液:60mmol/L,pH4.0。

        (2) 10×磷酸盐-NaCl 缓冲液(PBS):100mmol/L PBS,pH7.4。称NaCl 80g、Na2HPO412H2O 29g、KCl 2g、KH2PO4 2g,加蒸馏水溶解,加入100mmol/L EDTA 20ml,用去离子水定容至l000ml。

        (3) 透析液 10mmol/L Na2HPO4-KH2PO4缓冲液,含15mmol/L NaCl,pH7.2。

        (4) 硫酸铵。

        (5) 辛酸。


        四、操作步骤

        1、抗血清用4倍体积乙酸-乙酸钠缓冲液稀释,用0.1mol/L NaOH调至血清稀释液为pH4.5。

        2、室温下边搅拌(磁力搅拌器或电功搅拌器),边缓慢滴加辛酸(25ml/L血清稀释液),滴加完后继续搅拌30min。

        3、离心(10000r/min,30min),收集上清夜,弃去沉淀。

        4、上清液用多层纱布过滤。

        5、按1/10体积加入10×PBS,用5mol/L NaOH调至PH7.4。

        6、上清液4℃预冷,计算溶液总体积,在4℃按277g/L加入硫酸铵粉沫(45%饱和度),边加边搅拌,加完后继续搅拌30min。

        7、离心(5000r/min,15min)),弃去上清液。收集沉淀。

        8、沉淀用少量透析液溶解(一般为血清体积的1/10),透析并更换两次透析液或用Sephadex G-50脱盐。

        9、Ig溶液在50~55℃水浴中加热20min,离心(5000r/min,20min),上清液-20℃保存或冻干保存。

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