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        辛酸 - 硫酸铵法纯化单克隆抗体

        最新修订时间:

        简介

        辛酸-硫酸铵法纯化单克隆抗体不仅纯度和回收率可达 85% 以上,而且还能保持较好的抗体活性。

        原理

        辛酸-硫酸铵法纯化单克隆抗体的基本原理是辛酸(caprylic acid)在偏酸条件下能与血清或腹水中除 IgG 以外的其他蛋白质结合并将其沉淀下来,IgG 则溶于上清中。再用硫酸铵盐析,即可达到纯化 IgG 的目的。

        材料与仪器

        器材:电磁搅拌器,低温离心机,-20℃ 冰箱,电子天称,紫外分光光度计,烧杯,量筒,棕色小瓶,透析袋,塑料夹,精密 pH 试纸,转子,离心管,移液器等。。

        试剂:

        ① 小鼠腹水。
        ② 饱和硫酸铵溶液。
        ③ 0.06mol/L pH4.8 醋酸盐缓冲液。

        贮存液:

        A 液 0.06mol/L NaAc:无水 NaAc 0.49 g 加蒸馏水至 100 ml;

        B 液 0.06mol/L HAc:冰醋酸 0.36 ml 加蒸馏水至 100 ml。
        应用液:取 A 液 60 ml 与 B 液 40 ml 混合即可。
        ④ 0.1mol/L pH7.4 磷酸盐缓冲液(PBS):NaC l8 g,Na2HPO412 H20 28.94 g,KH2PO4 2.61 g,加双蒸 馏水至 1000 ml,用 HCl 调 pH 至 7.4,保存于室温。
        ⑤ 0.15mol/L pH7.4 磷酸缓冲盐液(PBS):8g NaCl, 0.2g KCl, 2.9 g Na2HPO412 H20, 0.2 g KH2PO4 溶于 1000 ml 双蒸水中,用 HCl 调 pH 至 7.4,保存于室温。

        步骤

        辛酸-硫酸铵法纯化单克隆抗体的基本过程可分为如下几步:

        A 小鼠腹水 4℃、12000 r/min 离心 15 分钟,去除杂质。
        B 取 1 份腹水与 2 份 0.06mol/L pH4.8 醋酸盐缓冲液混合,室温搅拌下逐滴加入正辛酸 33μl/ml 稀释的腹水。
        C 室温继续搅拌 30 分钟,4℃ 静置 2 小时以上,使其充分沉淀。
        D 4℃,12000 r/min 离心 30 分钟,弃沉淀。
        E 上清经 2.5μm 滤纸加压过滤后,移入透析袋中,塑料夹夹紧两端,放入 50-100 倍体积的 0.1mol/L pH7.4 PBS 中,4℃ 透析过夜,期间换液 2-3 次。
        F 室温搅拌下,在透析后的液体中逐滴加入饱和硫酸铵,使其终浓度为 45%。
        G 室温继续搅拌 30 分钟,4℃ 静置 2 小时以上,使其充分沉淀。
        H 4℃,12000 r/min 离心 30 分钟,弃上清。
        I 将沉淀溶于适量 0.15mol/L pH7.4 PBS 中,装入透析袋,4℃ 条件下对 50-100 倍体积的上述 PBS 透析,期间至少换液 3 次以上,至萘氏试剂测透析外液无黄色。
        L 4℃,12000 r/min 离心 3 分钟,除去不溶性沉渣。
        J 取少量透析后样品适当稀释后,以紫外分光光度计检测蛋白含量,SDS-PAGE 检测抗体纯度。
        K 分装抗体,置于-20℃ 或-80℃ 冰箱保存。


        注意事项

        1 盐析时,溶液中的蛋白浓度对沉淀有双重影响。蛋白浓度愈高,沉淀所需的盐饱和度极限愈低,杂蛋白可能发生共沉淀的几率也随之增加。因此,在盐析时血清或腹水都应作适当稀释,一般血清作倍比稀释,腹水作 2 倍稀释。

        2 辛酸-硫酸铵法也可用于纯化血清中的抗体,此时辛酸用量因抗体来源不同而稍有变化:人血清为 70μl/ml,兔血清为 75μl/ml,小鼠血清为 40μl/ml。

        3 不仅盐浓度与抗体的溶解度有关,pH 值对盐析也有影响。因此,选择适当的 pH 值可大大提高对 McAb 的沉淀效果。通常溶液的 pH 值与目标蛋白的等电点相等时,沉淀效果最好。

        4 该法主要用于 IgG1 和 IgG2b 的纯化,对 IgA 和 IgG3 的纯化效果及回收率都较差。

        来源:丁香实验

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