辛酸/硫酸铵法提纯IgG

一、原理

在酸性条件下( pH4.5)，非1gG的蛋白成份(包括白蛋白，部分Ig)，能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度较高的IgG。辛酸/硫酸铵法比硫酸铵法能够获得更高纯度的IgG。

二、材料与方法

1、材料

（1）动物腹水

（2）辛酸(caprylic acid，CA)，化学纯

（3）硫酸铵，分析纯

（4）SPA Sepharose 4FF亲合层析柱

2、操作方法

（1）蛋白含量测定

紫外分光光度法测样品在波长260nm，280nm处的I及收光度(A 260, A 280)，蛋白含量按以下公式计算

蛋白量（g/L）=(1.4undefined A 280- 0.7undefined A 260~undefined稀释倍数

（2）主要步骤

①腹水滤纸过滤去沉淀和脂质，滤液用4倍体积60mmo1/ L醋酸缓冲液(pH4.0)稀释后，用Na0H调，PH值至4.5。

②逐滴加入辛酸(终浓度25u1/ml)，室温h搅拌30分钟后，以6000-8000r/min.离心30分钟，收集上清液。

③上清液经滤纸过滤2次，将滤液与1undefinedPBS(0.lmol/L，pH7.4按10:1比例混合，调pH至7.4,置冰浴冷至40度。

④每毫升上述混合液加0.2778固体硫酸钱，40度搅拌30分钟，以4000-6000r/min离心巧一20分钟，将沉淀溶于少量YBS，透析，测蛋白含量，冻存。

（3）硫酸铵沉淀法

按常规方法将腹水分别经50%，33%饱和度硫酸铵沉淀。

（4）亲合层析

取提取的样品，用0.01lmol/ L Na2HPO4 (pH7.4)透析，洗脱使样品中IgG结合于层析柱上，再用0. lmol/ L柠檬酸(pH4.0)洗脱，收集洗脱液即获纯化IgG。

（5）SDS—PAGE电泳鉴定抗体纯度

（6）间接ELISA法测定抗体效价

用sIgA包被酶标板，按常规方法测抗体效价。处理细胞，包被酶标板，测定抗体效价。

（7）得率和回收率的计算

每毫升原腹水中提取的抗体量即为得率(Y field，g/ L );提取所得抗体量与原腹水中抗体量之百分比即为回收率(Recovery，%)。