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        间接原位PCR(原位杂交PCR)

        相关实验:间接原位 PCR(原位杂交PCR)

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        一、预杂交
         
        1.   试剂与配制
         
        2×SSC
         
        50%去离子甲酰胺:用4×SSC配制(v/v)
         
        预杂交液:2×SSC,5%硫酸葡聚糖,50%甲酰胺,0.2%脱脂奶粉
         
        2.   操作方法
         
        (1)在进行完原位PCR扩增后,用2×SSC预浸经乙醇脱水、空气干燥的玻片,并简洗15 min;
         
        (2) 用50%去离子甲酰胺37℃孵育15 min;
         
        (3)加预杂交液20 μl/片,在杂交温度下孵育30 min~2 h。
         
        二、杂交
         
        1.  试剂与配制
         
        杂交液:50%去离子甲酰胺,5×SSC,10%硫酸葡聚糖,5×Denhardt’s 液,2%SDS,10 mg/ml变性的鲑鱼精DNA
         
        2.  操作方法
         
        (1)弃预杂交液,加杂交液(含0.2~5 μg/ml探针)10~20 μl/片,覆盖经硅化的盖玻片,石蜡膜封片或橡皮泥封片;
         
        (2)玻片置于湿盒中,42℃杂交12~18 h(过夜,但不能超过24 h)。
         
        三、杂交后处理
         
        1.  试剂与配制
         
        2×SSC
         
        Rnase(20 μg/ml)
         
        50%去离子甲酰胺
         
        10 mmol/L DTT
         
        2.   操作方法
         
        1.   杂交完毕,用2×SSC浸泡玻片数分钟,轻轻移去盖玻片,再用2×SSC洗玻片1~2 min;
         
        2.   2×SSC(含20μg/ml RNase,适宜RNA探针,DNA探针可省略此步)中洗片30 min,37℃;
         
        3.   2×SSC/50%去离子甲酰胺,42℃×10 min;
         
        4.  1×SSC/50%去离子甲酰胺,37℃×30 min,2次;
         
        5.   4×SSC/10 mmol/L DTT洗1 h;
         
        6.   0.1×SSC洗2次,每次37℃×30 min;
         
        7.   PBS中洗10 min,即可进行显色,方法同上。

        注意事项

        1.  如果检测mRNA,双链探针应变性处理,方法是95~100℃加热10 min后迅速置于冰中骤冷;
         
        2.   以单链探针检测DNA时,DNA也需变性处理,将玻片置于70~80℃变性液(70%去离子甲酰胺,即甲酰胺/2×SSC,v/v)中10 min;
         
        3.   用双链探针检测DNA时,可按上述方法变性处理。

        来源:丁香实验

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