功能基因cDNA3'末端的克隆

一．原理

(1) 以目的mRNA 为模板，使用Oligo dT-3sites Adaptor Primer 进行反转录反应，合成1st Strand cDNA。

(2) 使用含有KpnI、XbaI、BamH I 酶切位点的上游特异性引物和3sites Adaptor Primer进行PCR反应。

(3) 使用限制性酶（KpnI、XbaI或BamH I）对PCR产物进行酶切反应。

(4) 选用适当载体克隆PCR产物并进行DNA测序。

二．材料与方法

1 材料

肝脏RNA

2 仪器、用具

PCR仪、0.2mlPCR管、移液器

3 试剂

(1) RNase Free H 2 O；10×RNA PCR Bμffer；MgCl2(5mM)；RNase Inhibitor(40μ/μl)；Oligo dt-3sites Adaptor Primer(2.5μM)；AMV Reverse Transcriptase XL(5μ/μl)

(2) ddH 2 O；10×PCR Bμffer；MgCl 2 (25mM)；3 sites Adaptor Primer(20μM)；TaKaRa Taq酶

4 方法

(1) 1st strand cDNA的合成

反应条件：30 ℃ 10min；55℃ 30min；95℃ 5min；5℃ 5min。

(2) PCR反应

① 1st PCR反应

a. 反应体系：

b．按以下条件进行反应：PCR扩增反应条件：94℃预变性3 min；然后进行30个循环反应，其温度循环条件为：94 ℃ 变性1 min ，55℃ 退火1 min，72 ℃延伸1 min；循环结束后 72 ℃ 再延伸5 min。

② 2nd PCR

a．反应体系：反应

b．按以下条件进行PCR反应：PCR扩增反应条件：94℃预变然后进行30个循环反应，其温度循环条件为：94 ℃ 变性1 min，1min，72 ℃ 延伸1 min；循环结束后72 ℃延伸5 min。c．反应结束后，取 PCR 反应液（5-10μl）进行琼脂糖凝胶电。

(3) 将2nd PCR 产物在 1% 琼脂糖凝胶上进行电泳分离。回收纯化电泳pMD-18T载体，进行鉴定和序列分析（方法同实验六、实验七）。

(4) 获得cDNA 3’末端序列后，将其与cDNA 的核心片断进行序列拼接。