双链cDNA末端补平

1. 在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂(promega):

6ul   10mM dNTP

2ul   T4 DNA Polymerase(8.7U/ul)

                   2ul   BSA(10mg/ml)

2. 稍微离心混匀反应物, 37℃反应至少30分钟,然后75℃灭活10分钟;

3. 加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈振荡后,常温下13000g离心5分钟;

4. 离心后,吸取上清于另一1.5ml eppendof管中,加入等体积氯仿,上下颠倒几次混匀后,常温下13000g离心5分钟;

5. 吸取上清至另一eppendof管,加入1/10V3M NaAc(PH5.2)和2.5V预冷的无水乙醇,混匀,-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA;

6. 第二日,将昨日沉淀物在4℃,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA;

7.离心完毕,弃上清,加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀,常温下13000g离心5分钟;

8.离心完毕,弃上清,干燥沉淀至无乙醇气味.

注：第3，第4步可以用PCR 纯化试剂盒代替。

PCR纯化试剂盒操作流程：

1．溶液PE使用前应加入适量体积95％－100％的乙醇，混匀。

2．向200ul二链补平产物中加入5倍体积的buffer PB，混匀。

3．加入spin column中，13000rpm离心1min。

4．加入0.75ml buffer PE，13000rpm离心1min。

5．13000rpm，再离心1min。

6．将spin column放入一新的离心管中，加入50ul buffer EB，静置10min。

7．13000rpm离心2min。

8．加入30ul buffer EB，静置10min。

9．13000rpm离心2min。

10．加入1/10体积3M的NaAc，2.5倍体积无水乙醇，混匀，－20℃沉淀过夜。

(责任编辑：大汉昆仑王)