功能基因cDNA 5’末端的克隆

一．原理

⑴ 5’-RACE法

① 以目的mRNA 为模板，使用5’末端P 标记的RT 引物进行反转录反应，合成1ststrand cDNA。

② 使用RNase H 分解 Hybrid DNA-RNA中的RNA链。

③ 使用T4 RNA Ligase 使单链cDNA进行环化或形成首尾连接物。

④ 进行PCR扩增。

⑵ 引物设计

二．材料与方法

1 材料

肝脏RNA

2 仪器、用具

PCR仪、0.2ml PCR管、移液器

3 试剂

(1)RNase Free H 2 O；10×RT PCR Bμffer (含dNTP Mixture)；RNase Inhibitor(40U/μl)；AMV Reverse Transcriptase XL (5U/μl)；RNase H (60U/μl)；5×Hybrid RNA Degradation Buffer；5×RNA (ssDNA)Ligation Buffer；T4 RNALigase； 40% PEG#6000

(2)ddH 2 O；10×PCR Buffe；MgCl 2 (25mM)；3 sites Adaptor Primer (20μM)；TaKaRa Taq 酶

(3)TE

(4)无水乙醇（预冷）

4 方法

(1)1st strand cDNA 的合成

② 反转录条件为：30℃ 10min；50℃

2)Hybrid RNA的分解

① 按下列组成配制RNA分解反应液：

② 上述反应液中加入1μl 的RNase H，30℃反应1h。

③ 上述反应液加入100μl ddH 2 O，500μl 冰冷的无水乙醇。

④ 混匀，-20℃放置30min，进行乙醇沉淀。

⑤ 14000rpm 离心10min，弃上清。

⑥ 加入500μl的70%乙醇。

⑦ 14000rpm 离心5min，弃上清，干燥沉淀。

(3)单链cDNA 环化（连接反应）

① 按下列组分配制连接反应液：

② 在上述沉淀中加入20μ 连接反应液，溶解DNA。

③ 加入20μl 40% PEG#6000，均匀混合。

④ 加入1μl T4 RNA Ligase，16℃过夜反应（15-18h）。

⑤ 连接反应结束后，将连接液用TE Buffer 稀释10 倍，-20℃保存备用。

(4)PCR 反应

① 1st PCR 反应

a.反应体系：

b．按以下条件进行反应：PCR扩增反应条件：94℃预变性3 min；然后进行25 个循环反应，其温度循环条件为：94 ℃ 变性1 min ，55℃ 退火1 min，72 ℃延伸1 min；循环结束后 72 ℃ 再延伸5 min。

② 2nd PCR 反应

a．反应体系：

b．按以下条件进行PCR 反应：PCR 扩增反应条件：94℃预变性3min；然后进行30 个循环反应，其温度循环条件为：94 ℃ 变性1 min，60℃退火1min，72 ℃ 延伸1 min；循环结束后 72 ℃ 再延伸5 min。

c．反应结束后，取 PCR 反应液（5-10μl）进行琼脂糖凝胶电泳。

(5)将2nd PCR 产物在 1% 琼脂糖凝胶上进行电泳分离。回收纯化电泳片段克隆到pMD-18T 载体，进行鉴定和序列分析（方法同实验六、实验七）。

(6)获得cDNA 5’末端序列后，将其与cDNA 的核心片断及3’末端序进行拼接。这就获得了cDNA的全序列。