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        怎样利用亲和层析法分选细胞?

        丁香实验

        1180

        免疫亲和层析法常用于蛋白质等生物大分子的纯化。但你是否想过,一根亲和层析柱子也能用来进行细胞分选,而且还不使用高亲和力抗体?

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        在细胞分选中,我们常常利用免疫识别特性来进行,比如流式分选(FACS)和免疫磁分选(MACS)。

        免疫细胞的划分是依据表面标志 CD 分子,可以被抗体识别。比如针对 CD4 + T 细胞这一特定类群,表面含有 CD45、CD3 和 CD4 标记。而表达 CD4 就是辅助性 T 细胞的特征。

        由此而来,免疫磁分选利用特定抗体偶联磁珠来捕获细胞。细胞与磁珠结合后,再利用磁分离器来分选。但具体选用何种方法,还是要看下游的研究。如果,想在选出的 CD4 + T 细胞上做基因功能研究,就不能采用会影响靶细胞基因表达或者会刺激细胞的方法,还得获得大量高纯度、高活力的细胞。

        而高亲和力抗体的使用,则不免对细胞产生刺激。

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        如果为了避免刺激细胞,不使用高亲和力抗体,细胞分选该如何进行呢?

        无踪免疫亲和层析(TACS)细胞分选

        对于这个问题,来自德国 IBA Lifesciences 的团队考虑到了亲和层析法。

        进行蛋白纯化最常用的方法之一,是亲和层析法,借助标签和配体的亲和力进行蛋白纯化。纯化的重组蛋白通常能以特异性的方式被洗脱,例如,在 Strep 标签蛋白纯化中,加入生物素(biotin)即可断开 Strep 标签与配体 Strep - Tactin 的作用,达到有效洗脱的目的。得到高纯度有活性的蛋白质应用在多种下游实验中,如研究蛋白质间相互作用等。

        那么是否可以以此为基础,将标签配体亲和力加以利用,结合免疫识别特性,用温和的方法得到高纯度的目的细胞呢?

        一、「画龙点睛」的表位标签—— Fab - Streps

        抗体具有高度特异性,按照功能划分的抗体有 Fab 区和 Fc 区。其中的 Fab 是抗原结合片段,对特异性抗原有亲和力(affinity)。

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        如果避免使用高亲和力抗体,可以考虑选取抗体上的 Fab 片段。将 Fab 与亲和 Strep 标签融合后,得到的表位标签Fab - Streps,留有抗体-抗原相互作用,还具备标签-配体相互作用。

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        Fab - Streps 的 Fab 段既对目的细胞的特异性 CD 标记有着亲和力,能抓取目的细胞;Strep 段又能结合亲和层析中,固定在多种介质上的配体 Strep - Tactin,如重力柱,磁珠,荧光等,一举两得。

        这样一个能应用于细胞分选的无踪免疫亲和层析方法称为 Fab - TACS(Fab - based traceless affinity cell selection)。

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        二、「无踪」label - free 的细胞分选

        除了能避免使用全长抗体在分选时对细胞的刺激外,这样建立的免疫亲和层析细胞分选方法有一个重要特性, 就是分选试剂可逆,从而也避免了分选后磁珠附着在细胞上的可能。

        从 Strep - tag 系统着手,充分利用了其温和可逆,高纯度的特点。这样的选后细胞表面不带「抗体标记」,为 label - free,从而避免了对下游实验的影响,如流式染色,体内、体外实验等。

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        三、简易的分选步骤

        亲和层析法的分选细胞的步骤是怎样进行的呢?其实和蛋白纯化并无明显区别。

        这里以使用重力柱的 Fab - TACS 分选为例:

        通过 加入 Fab - Streps - 加样 - 清洗 - 洗脱,完成目的细胞的分选。洗脱步骤中,加入生物素(biotin)即可作为竞争剂断开相互作用。

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        Step 1:加入 Fab - Streps

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        Step 2 :加入样品

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        Step 3:清洗

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        Step 4:洗脱

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        收集目的细胞

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