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        亲和柱层析法

        最新修订时间:

        原理

        该方法利用mRNA上的寡聚A可与较联寡聚T的纤维素柱在高盐下以碱基配对形式发生亲和吸附,而在低盐下,碱基配对能力破坏,吸附解除,而其他成分的RNA则不具该特性,因此在高盐下当RNA抽提样品流经该柱时,mRNA被挂在柱上,而其他RNA则随高盐溶液流出;当用低盐洗脱液洗柱时,mRNA随洗脱液流出。再用有机溶剂沉淀则可得纯化mRNA。

        材料与仪器

        步骤

        1.  DEPC处理层析柱。

        2.  0.1 M NaOH处理Oliga(dT)-纤维素。

        3.  用1×上样液洗柱至pH< 8.0。

        4.    无菌水溶解RNA,65℃温浴5分钟后,迅速冷却至室温,加等体积2×上样液,上样,分部收集。

        5.  1倍体积1×上样液洗柱,分部收集。

        6.  OD260沉淀收集液,确定收集液的该值是否接近0,如该值仍很大,则上样液继续洗柱,直至该值接近0。

        7.  2~3倍柱床体积的洗脱液,洗柱,分部收集。

        8.  测定各收集管的OD260,将有吸光值的各管合并。

        9.  在洗脱液中加入0.1体积的NaAC,1体积的异丙醇,-20℃沉淀过夜,12 000 g 离心10 min,75%乙醇洗沉淀,真空干燥。

        10.  提取mRNA质量的分光光度计检测,将所提mRAN分别在260,280 nm 比色,要求A.  OD260%/ OD280%不小于2.0及40 μg 所提样品在OD260%的值为1 。

        11.  提取mRNA质量的电泳检测,在1%的变性胶上,EB染色后,mRNA应在0.5-8 Kb 间均匀着色,1.5-2 Kb 间着色较强。

        来源:丁香实验

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