简易过碘酸钠法制备HRP结合物

　　本法是以 NaIO _４ 先将 HRP 表面的糖分子氧化成醛基，然后再与 Ig 上的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率高，将近 70 ％的 HRP 和 Ig 结合， 99 ％的 Ig 与酶结合，酶与 Ig 的活性无重大损失，是目前最常用的方法。

　　 1. 　原理：经典的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭 HRP 上残留的α - 和ε氨基基以避免酶分子之间的交联。后来 Wilson 等改用在低 PH 下使 NaIO ４氧化 HRP ，从而省去了二硝基氟苯封闭 HRP 步骤。 HRP 经 NaIO ４氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连，形成斯夫氏硷，后者可进一步用 NaBH ４ ( 或乙醇胺 ) 还原生成稳定的酶标记抗体。

　　 2. 　标记步骤 :
　　 (1) 　称取 5mgHRP 溶解于 1ml 蒸馏水中。
　　 (2) 　于上液中加入 0.2ml 新配的 0.1M NaIO ４溶液，室温下避光搅拌 20 分钟。
　　 (3) 　将上述溶液装入透析袋中，对 1mM PH4.4 的醋酸钠缓冲液透析， 4 ℃过夜。
　　 (4) 　加 20 μ l 0.2M PH9.5 碳酸盐缓冲液，使以上醛化桯 RP 的 PH 升高到 9.0 ～ 9.5 ，然后立即加入 10mg IgG( 抗体，或 SPA5mg) 在 1ml 0.01M 碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌 2 小时。
　　 (5) 　加 0.1ml 新配的 4mg ／ ml NaBH ４液，混匀，再置 4 ℃ 2 小时。
　　 (6) 　将上述液装入透析袋中，对 0.15M PH7.4 PBS 透析， 4 ℃过夜。
　　其余步骤 ( 纯化 ) 同戊二醛标记步骤的 (6) 、 (7) 、 (8) 。

　　 3. 　结果判定：
　　除标记物 IgG 量的计算，略有不同以外，其余均同戊二醛法。
　　 IgG 量 (mg ／ ml) ＝ (OD280nm-OD403nm × 0.3) × 0.62

　　 4. 　试剂及器材 :
　　 (1) 　 0.1M NaIO ４：称取 241mg 高碘酸钠 ( 广州化学试剂厂，批号 830602) 溶于蒸馏水 10ml 中。
　　 (2) 　 1mM PH4.4 醋酸钠缓冲液 :
　　 0.2M NaAc (1.361 克／ 50ml) 3.7ml
　　 0.2M HAc (0.601ml ／ 50ml) 6.3ml
　　加蒸馏水至 2,000ml 。
　　 (3) 　 0.2M PH9.5 碳酸盐缓冲液 :
　　　　　　　 Na _２ CO _３ 0.32 克
　　　　　　　 NaHCO _３ 0.586 克
　　　　　　　加蒸馏水至 50ml
　　再用蒸馏水作 20 倍稀释，即成 0.01M PH9.5 的碳酸盐缓冲液。

　　 (4) 　 NaBH _４ 溶液 (4mg ／ ml):
　　临用时称取 NaBH ４ 4mg 溶于 1ml 蒸馏水中。

　　 (5) 　其它的试剂及器材可参见戊二醛标记法。