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        制 备 VSV-G 结合物并用于基因传递

        相关实验:水泡性口炎病毒 G 蛋白结合物实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        制 备 VSV-G 结合物并用于基因传递

        材料

        试剂
        抗-V S V - G 单克隆抗体 P 5D 4 ( Sigma-Aldrich)

        B C A 蛋白质定量试剂盒(Pierce, Rockford, Illinois)

        细胞培养基

        H E K 293 细 胞(A T C C )

        磷酸盐缓冲液(P B S )

        质粒

        报道基因表达质粒(如 E G F P -N l , B D Biosciences, Palo Alto, California)

        V S V - G 表达质粒 p H C M V - G (Yee et al.1994a , b)

        Polybrene (4m g / m l 储液)

        S D S ——P A G E 和银染试剂

        Western blot 分析试剂

        受体细胞

        蔗 糖(20%) / P B S

        仪器

        离心机,配 备 S W 2 8 转子和离心管(B e c k m a n)

        SDS-PAGE 和银染设备

        Western blot 分析设备

        微 孔 滤 膜(〇.45um)

        细 胞 板(6 孔)

        组织培养皿(IOcm)

        37°C 水浴

        方法

        制 备 VSV-G

        任何转染方法都可以把 VSV-G 表达质粒转人到细胞中,以表达 VSV-G 蛋白。我们一般选用 HEK293 细胞系,因为它可以用包括 CaP 〇 4_D N A 共沉淀在内的任何方法进行转染,而且都具有高的转染(Yeeetal.1994a, b)。

        1•转染 24 h 前 ,在 I O c m 培养皿中,用合适的培养液,以 大 约 7 〇% 的细胞密度接种H E K 293 细胞,生长过夜。

        在转染时,细胞密度应该达到 90%〜100%。

        2•用标准的 CaPCVDNA 共 沉 淀 方 法 转 染 1 〇〜2 〇ug的 PHCMV-G 质 粒 到 HEK293细胞。

        因为 HEK293 细胞对 CaPO4 沉淀的毒性敏感,所以转染时间应短于 8 h。

        3.第二天,更换新鲜培养液。

        因为 V S V - G 的融合作用,可能形成的多核体,但在这一时间应该还不明显。继续培养过夜。

        4 . 此时多核体应该非常明显。收集培养液, 0.45um滤膜过滤,一 70°C 储存。加人新鲜培养液到细胞中,并继续培养过夜。

        5.许多细胞可能飘浮起来,收集培养液,同步骤 4 过滤 。 一 70°C 储存或进行纯化。

        部 分纯化 VSV-G (简单方法)

        6.部分纯化 V S V -G ,步骤如下:
        a. 把转染 2d 和 3d 收获的培养基在 37°C 水浴中解冻并混合。将培养液转移到 B e c k-manSW28 转子专用离心管中, 4℃以 25000r/min离心 2h,弃上清。用 5〜IOml P B S 重 悬 沉 淀 。如 果 培 养 基 多 于 200m l ,可 用 大 容 量 转 子 6000〜7000r/m i n 过夜离心来收集 V S V -G 。

        b . 低速离心除去不溶性碎片(如 4°C , 3000r/m i n 离 心 l O m i n)。把上清加到 20%的蔗糖/ P B S (5m l ) 中,置 入 S W 28 转子的离心管中,用 P B S 覆盖并填满离心管, 25 000r/m i n 离 心 6 h 或过夜。弃上清,用 100〜20(V 1P B S 重悬沉淀。

        c. 用 BCA 蛋白质定量试剂盒测量 VSV-G 蛋白的浓度。蛋白质纯度经 SD& PAGE、银染和 Western blot 分析估计,使用抗-VSV-G 单克隆抗体 P5D4。

        用 VSV-G 转染

        7 . 转染前 24 h ,在 6 孔板中,用合适的培养基接种待转染细胞,培养过夜

        8•减少孔中的培养液至每孔 lm l, 加 人 POlybr e n e 到 培 养 液 中(4ug/ml)。在一个小离心管中,将 2〜5 ug的质粒 DNA (如 PEGFP-N1 ) 和 10ul 大 约 1ug 的 VSV-G 溶液混合。将其快速加人到细胞中。
        也可以将质粒 D N A 直接加人到含有 Im l 培养液的细胞中,培 养 15m in 后 ,加 人 polybrene和 VSV-G 。

        9•混匀,置入培养箱中培养 2〜6 h ,然后每孔补加 Im l 新鲜培养基,继续培养。如果碎片较多,洗涤细胞并加 2m l 新鲜培养基。

        10•在 1〜3d , 测量转基因表达,以评估细胞的转染效率

        来源:丁香实验

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