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        酚/SDS法制备植物RNA

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        一 材料与设备

        1) 液氮

        2) 研磨缓冲液 18mol/LTris,0.09mol/LLiCl,4.5 mmol/LEDTA,1%SDS,用 HC1 调 pH 至 8.2。此缓冲液与加了 1/10 体积 10%SDS 的 TLE 缓冲液相当

        3)TLE 缓冲液平衡酚(TLE 缓冲液:0,2mol/LTris,0.lmol/LLiCl,5 mmol/LEDTA,用 HC1 调 pH 至 8.2)

        4) 氯仿

        5)8mol/L 和 2mol/LIiCl 溶液 (DEPC 处理)

        6)3mol/L 乙酸钠 (DEPC 处理)

        7) 无水乙醇

        S)DEPC 处理水

        9)Folytron 匀浆器(BrinkmarmPT10/35)


        二 操作方法

        1) 研钵和研杵先用液氮冷却,称出 15 g 冻结植物组织放置于研钵中 (加液氮保持冻结),用研杵磨成粉末,立即转移到一个盛有 150 mL 研磨缓冲液和 50 ml TLE 缓冲液平衡酚的 500 ml 烧杯中

        2)Polytron 匀浆器,设定在 5〜6 档匀浆 2 min. 加人 50 ml 氯仿,并用勻浆器在低速下混句。将混合物移至 500 ml 离心瓶中,于 50℃ 加热 20 min

        3) 于 4℃ 在 17700 g 下离心 20 min。将上层水相移至另一个干净离心瓶中界面保待后继步骤 4 处理),加入 50 mlTLE 缓冲液平衡酚,混匀,再加 50m 氯仿。

        4) 将上步残余的水相连同界面 h 的物质移入一个 50 ml 离心管中,于 4℃12100 g 离心 20 min。

        5) 吸出水相,与步骤 3 的水相及酚、氯仿混合物合并,剧烈混合。

        6) 于 4℃17700 g 离心 15 min, 水相移入另一干净 500 ml 离心瓶。

        7) 用 TLE 平衡酚反复抽提水相. 直至两相间界面干净为止,水相再以氯仿抽提。

        8) 将水相移入 250 ml 离心瓶中,加入 LiCl 至终浓度为 2mol/L(加约 0.33 体积的 8mol/LLiCl) 在 4℃ 沉淀并过夜。

        9) 于 4℃15300 g 离心 20 min,沉淀以 2〜3 ml2mol/LLiCI 溶液洗涤

        10) 沉淀以 5 ml 水重溶,并移人 15 ml 离心管中,加人 LiCl 溶液至 2mol/L., 于 4°C 沉淀 RNA2 h 以上。

        11) 于 4℃15300(¾离心 20 min, 用 2mol/LLiCl 溶液洗涤一次,重溶于 2 ml 水,加入200ul 3mol/L 乙酸钠溶液和 5.5 ml 无水乙醇,一 20℃ 沉淀过夜或在干冰/乙醇中沉淀 30 min

        12) 于 4℃17700 g 离心 15 min 用 1 ml 水重溶沉淀。取 10ul 稀释至 lml 测 OD260 和 OD280。

        注意事项

        适于制备 RNA 的原材料 (如豌豆种子)15 g 即可获得 7 mg 总 RNA, 但 15 g 成熟的拟南芥原料可得总 RNA

        来源:丁香实验

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