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        HRP标记抗体的方法(戊二醛二步法与简易过碘酸钠法)

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        酶与抗体交联的方法有许多种,根据酶的结构不同可采用不同的方法。对于制备HRP结合物,可用戊二醛二步法和过碘酸钠法。尤以简易过碘酸钠法更为常用。


          戊二醛二步法
          1. 原理:戊二醛为一种双功能试剂,通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白 上的氨基共价结合,形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。

          2. 标记步骤:

          (1) 称取HRP25mg溶于1.25%戊二醛溶液中,于室温静置过夜。

          (2) 反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱 ,用生理盐水洗脱。流速控制在1ml/1分钟,收集棕色流出液。如体积大于5ml,则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中,缓慢搅拌。

          (3) 将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml,搅拌下逐滴加入酶溶液中。

          (4) 用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml,继续搅拌3?小时。

          (5) 加0.2M赖氨酸0.25ml,混匀后,置室温2小时。

          (6) 在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵,置4℃1小时。

          (7) 3000rpm离心半小时,弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次,最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS 中。

          (8) 将上述溶液装入透析袋中,对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析,去除铵离子后(用萘氏试剂检测),10,000rpm离心30分钟去除沉淀,上清液即为酶结合物,分装后,冰冻保存。

          3. 结果判定:

          (1) 定性及效价滴定:用特异性抗原(或抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色,可初步鉴定其活性。最后以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合物进行滴定( 见本节 (三)工作浓度的选择)。

          (2) 定量和克分子比值测定:可用分光光度计测定(光程1cm)。

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